GFP-绿色荧光蛋白.ppt

1、概述绿色荧光蛋白在抗肿瘤药物研究中的应用，1962年Shimomure等人首先从维多阿克拉格(Aequorea Victoria )中分离出了GFP (Green-Fluorescent Protein )。 1992年Prasher等人克隆复制了GFP基因的cDNA，并对GFP的初生结构进行了分析。 1994年Chalfie等人首次在大肠菌群细胞球和线虫中发现了GFP，开创了GFP应用研究的先河。 此后不久发现GFP可以在多种异源细胞球中表达，GFP在细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域迅速掀起热潮。 GFP的发光特性、GFP吸收的光谱、最大峰为395nm (紫外)、峰为470nm的副峰(

2、蓝光)的发光色光谱的最大峰为509nm (绿色光)，峰具有540nm的侧峰。 由于GFP的光谱特性与萤光素异硫氰酸酯(FITC )非常类似，因此针对萤光素FITC而设置的落射荧光显微镜过滤烟嘴的组合也适用于GFP观察。 450490nm (蓝光)是GFP的副吸收峰，但长波能量低，细胞球的容错技术强，因此适合于生物检测。 GFP的性质、GFP荧光极为稳定，在激发光照射下，GFP的光漂白能力比萤光素强，特别是在450490nm蓝色光波长下更稳定。 GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂将GFP转换为非荧光形式，但再暴露在空气和氧气中后，GFP荧光立即恢复。 一些弱还原剂对GFP荧光没有影响。 中

3、等程度的氟化剂，对生物材料的固定，脱水剂谷氨酸，甲醛等，GFP荧光也基本没有影响。 GFP融合蛋白的荧光灵敏度远高于萤光素标识牌的荧光抗体，抗光漂白能力强，适用于定量测量和分析。 然而，GFP灵敏度可能低于一些酶体系报告蛋白质，这是因为GFP不是酶催化剂，荧光信号没有酶催化剂学放大效应。 GFP荧光是生物细胞球的自主功能，荧光的产生不需要外源反应基质，因此GFP作为一种广泛应用的生物报告蛋白，其作用不能与其他酶催化剂类报告蛋白相媲美。 comparisonofgfpandluciferaseimaging，GFP在生物医药中的应用，GFP采用转基因研究GFP融合蛋白作为新的报告基因，进行蛋白质

4、定位、 转移及相互作用研究生细胞球分子变化过程发育分子反应历程研究示踪物致病菌临床检测在肿瘤研究中的应用GFP在肿瘤研究中的应用GFP在肿瘤发病机制研究中的应用GFP在肿瘤血管形成检测中的应用， 在GFP肿瘤发病机制研究中的应用，GFP是一种分子量小的蛋白，容易与其他一些目的基因形成融合蛋白，不影响自身目的基因产物的空间结构和功能。 GFP与目的基因融合，绿色标记目的基因可定量分析目的基因表达水平，显示其在肿瘤细胞球内的表达位置和数量变化，为探讨该基因在肿瘤发生发展中的作用及其分子反应历程提供便利条件。 在肿瘤的形成过程中，增殖和凋亡是一对不符点的统一。 如果肿瘤细胞球凋亡占优势，则肿瘤组织长

5、期处于休眠状态或自行消亡。 肿瘤细胞球的细胞凋亡由凋亡相关基因调控。 用GFP转染肿瘤细胞球凋亡相关基因，与正常组织比较，若过度表达，几乎可断定该基因是抑制肿瘤细胞球凋亡的基因，相反，是促进肿瘤细胞球凋亡的基因。 肿瘤细胞球浸润是肿瘤细胞球黏附、酶催化剂分解、迁移和基质内增殖等一系列过程的表现，其根本原因在于肿瘤细胞球内某些基因表达异常。 利用GFP的示踪物特性，研究肿瘤细胞球内某些基因异常表达与肿瘤细胞球浸润的关系，从而可揭示肿瘤细胞球浸润的某些反应历程。 研究GFP在肿瘤发生发展研究中的应用、肿瘤的生长、浸润和转移的传统方法是将肿瘤负载动物分阶段处死，制作光学或免疫组织切片观察，或者用CT

6、、ECT、MRI、PET等成像仪器检测。为了深入了解肿瘤的生物科学行为特点，即使使用大量动物和昂贵的设备，也难以连续、动态地观察肿瘤细胞球的生长、肿瘤形成过程。 有报道将标识牌荧光染料的肿瘤细胞球通过血管注射到动物体内，研究转移病灶的形成过程，但由于标识牌后肿瘤细胞球的荧光信号容易衰减，肿瘤细胞球分裂，所以通常难以显示或追踪23天后荧光标识牌的肿瘤细胞球。 为了克服上述缺陷，Yang等人建立了在生物体内能够连续、反复、动态地观察肿瘤细胞球生长和肿瘤形成过程的方法。 外部whole-bodyimagesofthebxpc-3-gfpprimarytumorcomparedwithinternal

7、images.a，fluorescentimagesoftheprimarypancreation bowel (B )，and spleen (s ) metas tass animageofthesamemouseafterlaparotomyinternallylocalizedtheexternalimagesofmetastatictumors .皮下位于较深部位的肿瘤，其发出的荧光会受到周围组织，特别是皮肤的干扰，因此小肿瘤灶常常难以显示。 因此，Yang等人在待检查器官上制作了可逆的皮瓣，观察时打开皮瓣，建立了荧光途径，大大提高了检查的敏感性，可以检查脑内、肝内的单一肿瘤细胞球和

8、多个肿瘤细胞球形成的肺内微小肿瘤灶。Bladder cancer models Features、ku-7-gfphumanbladdercarcinomagrowingonnudemousebladder，近年来随着研究的进展，有越来越多的模型， humanu-87-rfpgliomagrowinginbrainofnudemouse.whole-body image .brain cancer模型特性、orthotopictransplantationgreenflu orthotopictransplantationofintacttissuemetastaticsiteslymphno

9、desliverlungskeletonestrogen -从属存储-从属存储p scentproteinexpression，MX-1-gfpandrfpbreastcarcinomagrowingonmammaryfatpadsofscidmouse。 爆炸取消器模型特性、人机lox-1-gfpmelanomametastasizedtolung (a )、lymp节点(b )、波恩(c )机械模型特性， orthotopictransplantationofintacttissuemetastaticsiteslymphnodeslungskeletonbrainkidneyadrena

10、lglandd lung cancer模型特性， orthotopictransplantationofintacttissuemetastaticsiteslymphnodescontrallungkidneyskeletonesophagusdiaphragmbrainheartsma lcarcinomadenocarcinomagreenfluorescentproteinexpression、先进取消器模型特性， orthotopictransplantationofintacttissuemetastaticsiteslymphnodesliverlungskeletongreen

11、fluorescentproteinexpressionredfluoresce nugc-4-gfphumanstomachtumorinnudemouse.primary tumor -红色阵列， lymphnodemetastases -白天存储取消器模型特性， orthotopictransplantationofintacttissuemetastaticsiteslymphnodesliverlungpancreasadrenalglandkidneyperitoneumgreenfluorescentp 与rib (b ) metastasesofpc-3-gfphumanpro

12、statecarcinomagrowingorthotopicallyinnudemude skeletalmetastasisofb 16-gfpmousemelanom skeletalmetastasesofh 460-gfphumanlungcancerorthotopicallygrowinginnudemousetibia (a )、skull (b )和femur (c () GFP在肿瘤血管形成检查中的应用，肿瘤因此，可以测量肿瘤内的微血管密度(microvessel dentisity，MVD )，判断患者的预后，通常，测量MVD的方法是以抗血管内皮细胞抗体显示血管，并计数阳性染色的新生血管数。由于切片固定和脱水过程中组织体积和形状的改变，免疫组织化法得到的MVD值不可靠，GFP在抗