高速逆流色谱溶剂体系筛选及其联用技术

1、高速逆流色谱溶剂体系筛选及其联用技术 晋晓峰 研发部副主管 上海同田生物技术有限公司,报告内容,一、溶剂体系筛选方法 二、高速逆流色谱联用 三、关于上海同田生物,一、溶剂体系筛选方法,HSCCC分离条件,基本原则: 不造成样品分解或变性 对样品有较大溶解度 固定相在分离柱中有较好保留 样品在两相溶剂系统中有合适的分配系数,溶剂体系的筛选方法,1. 分配系数（ K ）法 K Cs/Cm Cs为溶质在固定相中的质量浓度 Cm为溶质在流动相中的质量浓度 Cs和Cm的比值可通过HPLC测得 理想的分配比值 k = 0.52，允许0.25,两种溶质分离因子： K1/K2（1.5）,当Cs / Cm 0.

2、5时，出峰时间太快，分离度较差 当Cs / Cm 2时，出峰时间太长，且峰形变宽,芦荟提取物的HPLC图谱,实例（HPLC法测K值）,芦荟未知物,芦荟苷A,芦荟苷B, 上层 下层,芦荟未知物,芦荟苷A,芦荟苷B,芦荟提取物的HSCCC图谱,芦荟苷B,芦荟苷A,芦荟未知物,对已知化合物类别的物质可参考相关文献，在文献提供的体系的基础上进行调整 对未知样品，可采用氯仿-甲醇-水=10-3-7或正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水=1-1-1-1两个极性分布范围较广的体系先进行尝试，也可以根据样品的极性选择相对应的溶剂体系，再根据目标组分的分配系数进行调整,2. 经验法,溶剂体系根据极性可以分为三类： 疏水性

3、（石油醚体系，正已烷体系） 中等疏水性（氯仿体系，甲基叔丁基醚体系） 亲水性（正丁醇体系，乙酸乙酯体系）,3. 分析型HSCCC法 优点： 分析时间短 溶剂消耗少 进样量小，节省样品 确定的体系可直接用于 放大制备，重现性佳,仪器：TBE-20A 转速：1600r/min 流速：0.5ml/min样品：8沙棘提取物体系：正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水 洗脱方式：下相作为流动相,实例（分析型HSCCC法）,1：1：1.2：0.8,1：1.2：1.2：0.8,0.8：1.2：1.2：1.2,0.8：1.2：1.2：1.5,正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水（0.8：1.2：1.2：1.7）,槲皮素,山萘酚,异

4、鼠李素,HSCCC工艺重现性,TBE-20A 分析型HSCCC,TBE-300B 半制备型HSCCC,TBE-1000A 制备型HSCCC,4.多元溶剂体系的选择方法 Ito方法 HBAW方法 ARIZONA方法,Ito认为溶剂体系的筛选可以从氯仿-甲醇-水(2:1:1)开始，如果分配系数落在0.2-5的范围内，通过调整可以获得满意的分配系数。如果样品主要分布在非水相的下相中时，应尝试下表中箭头向上的体系，如果样品主要分布在上相时，则应试验相反方向的体系。,BHAW方法是将非极性溶剂体系正已烷-乙腈（1:1）和极性溶剂体系正丁醇-水（1:1）结合起来，形成了7种多元溶剂体系，编号为-3+3 首

5、先试验0号溶剂体系，以确定下一步试验的方向。如果样品倾向于极性的水相，应该进一步实验0+3号正方向的体系，否则应该试验0-3号反方向的体系 这组溶剂的特点是紫外透明性很好,ARIZONA方法是结合乙酸乙酯-水体系（1：1，体系A，极性）和正庚烷-甲醇体系（1：1，体系Z，非极性）定义了23种整个溶剂范围内的溶剂体系，并用AZ的23个字母（E，I，O除外）表示 操作时只需做两个实验，将样品分别溶解在体系A和体系Z中，如果绝大部分样品集中在体系A的乙酸乙酯相和体系Z的甲醇相，那就有可能在体系AZ中找到一个合适的体系,小结： 溶剂体系的选择是HSCCC分离中最关键也是难度最大的一个环节，一般从样品的

6、溶解度，通过参考文献及常用体系, 测定K值等来筛选溶剂体系，然后再通过上述提到的各种方法进行调整。 随着逆流色谱技术的普及，越来越多的人致力于体系筛选的研究工作。,二、高速逆流色谱联用技术,TBE-300A+KTAPrime,TBE-300A主机接口,1. HSCCC与KTA系列中压系统的联用,注意事项： KTA系列设备的出场设置的最高压力为1MPa，适合HSCCC的02MPa压力范围；如不是，需要设置最高压力为12MPa KTA系列的连接接头为M5型号，而HSCCC为M6型号接头，所以连接时需要使用转换接头,2. HSCCC与ELSD的联用技术,优势： 基于样品的浓度 梯度洗脱时基线稳定，无

7、溶剂峰 可用于检测挥发性低于溶剂的任何化合物 HSCCC-ELSD联用技术已成功用于脂肪酸，生物碱，皂苷类，萜类，甾体类等的分离,注意事项： ELSD连接接头为M5型号，而HSCCC为M6型号，所以连接时需要使用转换接头(厂家提供) 半制备型和制备型HSCCC与ELSD检测器联用时，需用分流器实现同时检测与馏分的收集,分流器解析图,三通管,HSCCC组分流出口,调速阀,组分收集,分流进入ELSD检测器,分流进入收集器,三通管,3. HSCCC-ESI-MS联用技术,高速逆流色谱与热喷雾式质谱联用法是一种新近发展起 来的、具有适用范围广和灵敏度高等特点的分析方法 可直接用于复杂样品中有关成分的鉴

8、别和测定 不需要对流出液做任何分离就可用于鉴定，降低了分离过程对样品造成污染的可能性 适用于分析非挥发性或热不稳定性物质 分析速度快,HSCCC-ESI-MS,Oka等解决了HSCCC与质谱联用的根本问题即接口问题，设计了T型连接器，发现联用并不影响色谱的分离和质谱的分析 HSCCC-ESI-MS联用技术已成功地用于同时在线分离和分析丹参酮A，EGCG，三萜酸，多肽，多酚类和黄酮类等,HSCCC能够获得高的溶质-溶剂比的流出物，从而使流动相吸收红外光谱的问题得到缓解 高速逆流色谱与傅里叶红外光谱的联用只需要一个简单的流动池接口，不需要其他附加的去除溶剂的方法,4. HSCCC-FT-IR联用技

9、术,优点： 可以在分离的同时获得被分离物的结构信息 缺点： 需要较大的样品量（每种组分0.2-1mg）,Romanach和De Haseth应用HSCCC-FT-IR联用技术成功地对苯酚、硝基苯酚以及乙酰苯酚等进行了分离与鉴定，在线记录相应的IR光谱,小结： 随着HSCCC的普及，HSCCC与多种其他技术联用，为HSCCC的应用扩展了更大的空间。,三、关于上海同田生物技术有限公司,公司位于上海张江科技园，占地约30亩，建筑面积约20000平方米，总投资人民币6000万元。 2008年11月25日，上海市高新技术企业认定办公室公告，上海同田生物技术有限公司被认定为上海市2008年第一批高新技术企

10、业。,公司致力于高速逆流色谱仪（HSCCC）、高纯度天然产物有效成分单体、天然药物原料/中间体的研究开发、生产和销售。,作为多分离柱高速逆流色谱仪国家新型专利的拥有者、高速逆流色谱领域的领导者，我们与通用电气医疗生物科学中国有限公司（GE Healthcare Bio-sciences co., ltd .）建立了长期的合作伙伴关系。,TBE300BKTA Prime,在高速逆流色谱技术领域，公司所研制并批量生产拥有自主知识产权的新型多分离柱高速逆流色谱仪，性能稳定可靠，有分析型、半制备型、制备型等7种不同产品：,国内部分代表客户名单： 香港赛马会中药研究院 香港大学植物系 中国科学院过程工程

11、研究所（北京） 中国科学院植物研究所（北京） 国家中药制药工程技术研究中心（上海） 山东绿叶天然药物研究开发有限公司 山东聊城大学化工学院,泰国,德国,公司于2008年底已在西班牙，比利时，韩国，泰国，新加坡，瑞士，南非，捷克，意大利，印度等十一个国家设立了代理商。,中国对照品行业领导者，ISO 9001：2000质量管理体系认证企业 长达10年的对照品研发及标准制定经验,同田对照品均通过严格的质量检测，附HPLC 检测报告，大部分产品可提供NMR, MS等图谱。,银杏内酯 B,银杏内酯 A,银杏内酯 C,部分对照品获得国家质量监督检验检疫总局颁发的标准物质证书,天然植物单体提取物 上海市高新技术成果转化项目, 上海市高新技术成果转化项目,同田对照品质量目前已得到美国，德国，瑞士，英国，新加坡等多家标准品经