AML1ETO融合基因相关白血病中EEN基因参与的分子发病机制的研究.doc

1、 上海交通大学博士学位论文AML1-ETO融合基因相关白血病中EEN基因参与的分子发病机制的研究姓名：马立恒申请学位级别：博士专业：遗传学指导教师：陈竺20060401 上海交通大学博士学位论文AML1-ETO融合基因相关白血病中EEN基因参与的分子发病机制的研究摘 要t（8；21）（q21；q22）是急性髓系白血病中常见的染色体易位，这种易位主要导致AML1-ETO融合基因的产生以及AML-M2的发生，约占AML-M2b的90。EEN基因则是作为MLL基因的融合伙伴基因在一例急性单核细胞白血病病人中首次克隆。在MLL-EEN融合蛋白中，保留了大部分的EEN蛋白。相关的研究表明，MLL基因的融

2、合伙伴基因对MLL融合基因的致白血病作用是必须的，这说明，融合伙伴EEN在白血病发生中至关重要。 在本研究中，我们筛选了不同细胞株中EEN的表达情况。发现EEN在Kasumi-1细胞中的表达比其他细胞株有明显的升高。于是我们比较了携带不同融合基因的白血病患者骨髓cDNA中EEN的表达量。发现具有AML1-ETO融合基因的M2b患者的EEN的表达量也有上调。继而，在松甾酮A （Ponasterone A，PA）诱导表达AML1-ETO的U937细胞株中，通1 上海交通大学博士学位论文过RT-PCR和Western证实，EEN的RNA和蛋白质水平都随着AML1-ETO的诱导表达而升高。 为了研究A

3、ML1-ETO与EEN之间的调控关系以及在白血病发生过程中的作用，我们分析了EEN基因的启动子和相关的转录调控机制。我们首先利用RNA酶保护试验确定了EEN基因的转录起始位点位于ATG起始密码子上游144bp处。通过对EEN启动子区可能的转录元件分析，找到了Sp1和一个AML1的潜在的结合位点（TGCGGT）。随后，我们利用染色质免疫共沉淀证实AML1-ETO可以通过这一结合位点与EEN的启动子结合。通过这一结合，AML1-ETO可以异常激活EEN基因的转录，而AML1则没有这个作用。 由于过表达的AML1不具有激活EEN基因的功能，所以，说明其他的转录因子对EEN的表达发挥了主要作用。这样我

4、们通过EMSA和转录报告试验研究了Sp1对EEN基因的调控，证实Sp1可以结合到EEN的启动子区，并显著激活EEN基因的转录。 EEN基因在染色体上与CAF1基因呈头对头的排列方式，所以，AML1-ETO可能可以调变CAF1基因的转录。我们发现，Sp1的结合位点序列与已知的绝缘子序列具有同源性。我们将该序列插入SV40的启动子和2 上海交通大学博士学位论文增强子之间，通过报告试验证实该序列在EEN基因方向上，可以激活EEN基因的转录。而在CAF1基因方向上，该位点具有阻断AML1-ETO对CAF1基因的转录激活作用，发挥绝缘子的作用。RT-PCR的结果也显示，在松甾酮A （Ponasteron

5、e A，PA）诱导表达AML1-ETO的U937细胞株中，CAF1基因的表达与AML1-ETO的含量没有具体时相联系。这说明，该绝缘子在体内具有活性。同时，在该诱导表达体系中，Sp1蛋白的含量没有明显的变化。 同时，我们研究了EEN基因的肿瘤转化能力，高表达EEN基因的稳转细胞株HL60增殖能力增加，高表达EEN基因的稳转细胞株NIH-3T3注射于裸鼠皮下可以导致肿瘤。初步的分子机制的研究表明，EEN能够增强原癌基因AP-1的活性。这提示，EEN的高表达的分子机制可能是通过激活AP-1途径来发挥作用的。为了进一步研究EEN在M2b白血病发生中的作用，我们还建立了RNA干扰的Kasumi-1和H

6、L60稳定转染细胞模型，为进一步的工作打下了良好的基础。 关键词：AML1-ETO，EEN，融合基因，急性白血病，转录因子，RNA干扰3 上海交通大学博士学位论文THE INVOLMENT OF EEN GENE IN THE LEUKEMOGENISES OF AML1-ETOFUSION GENE ASSOCIATED LEUKEMIAABSTRACTThe t(8;21)( q22;q22) translocation is one of the most frequent chromosomaltranslocations associated with human acute mye

7、loid leukemia (AML), accounting forapproximately 40% of M2 AML and 12% of de novo AML cases. The translocationjuxtaposes the AML1 gene on chromosome 21 to the ETO gene on chromosome 8, andcreates AML1-ETO fusion which is proved to be a transcriptional factor.The EEN (extra eleven nineteen) gene loca

8、ted at chromosome band 19p13 wasoriginally cloned from a case of acute myeloid leukemia M5 subtype with translocation t(11; 19)(q23; p13). This translocation results in the formation of the MLL-EEN fusionprotein, in which almost the entire EEN protein fuses to the N-terminal part of the MLLprotein.

9、Research in the leukemogenesis of MLL associated leukemia indicates that thefusion partners of MLL are of importance in this pathophysiological process.In our research, we screened diverse cell lines to investigate the expression of EENand the possible relationship to different leukemia subtypes. We

10、 found significant highlevel of EEN expression in Kasumi-1 cell by RT-PCR. We also tested the bone marrow4 上海交通大学博士学位论文samples of different leukemia subtypes, which also suggested relative high level of EENexpression in M2b. Furthermore, using the Ponasterone A (PA)-inducible AML1-ETOexpressing U937

11、 cell line, we verified the increase of EEN mRNA level as well as theprotein levels with the induction of AML1-ETO.To investigate the possible regulation of AML1-ETO on EEN and related mechanisminvolved in the leukemogenesis, we analyzed the EEN promoter region and identified theregulatory elements

12、of EEN gene. We performed an RNase protection assay (RPA) andrevealed a major TSS 144 bp upstream of the ATG. We also found a possible Sp1 bindingsite and AML1 binding site (TGCGGT) in the promoter region of EEN. Subsequently, weverified AML1-ETO could bind the EEN promoter through the binding site

13、usingchromatin immunoprecipitation (ChIP). And through this binding, the expression of EENcould be activated by AML1-ETO but not AML1.The incapability of AML1 on the EEN activation indicated other possible transcriptorsinvolved in this process. Using EMSA and transcription reporter assay, we studied

14、 theregulation role of Sp1 and verified Sp1 could bind the EEN promoter and activated theEEN expression significantly.Since EEN and CAF1 genes (GenBank Accession No.U20979) are locatedhead-to-head within less than 3kb intergenic region which contains an AML1 binding site,we wondered if the transcrip

15、tional factors including AML1-ETO could simultaneouslytransactivate both genes. We did not found the upregulation of CAF1 genes byAML1-ETO. We found that the Sp1 binding sequence had similar feature to the knowninsulators. We inserted this sequence between the SV40 enhancer and promoter to test thei

16、nfluence of orientation on the transactivation. The report assay results indicated this5 上海交通大学博士学位论文sequence is an insulator in the orientation of CAF1 gene. In the PA inducible AML1-ETOexpressing U937 cells, CAF1 gene was not affected by AML1-ETO, suggestion the in vivoactivity of this insulator-l

17、ike element. We also found the Sp1 protein level did not changein the PA induction U937 cells.Moreover, overexpressed EEN turned out to be oncogenic. By using the stable cellline HL60 transfected with EEN, we found high level of EEN enhanced HL60proliferation. Nude mice subcutaneously injected with

18、NIH3T3 stablely transfected withEEN cells developed tumors.We found that the overexpression of EEN did transactivate AP-1, which was validatedin NIH3T3 and HL60 cell lines, as well as other three cell lines: COS7, K562 and U937,suggesting the possible leukemogenesis mechanism through AP-1 activation

19、.To explore how the expression of EEN gene is involved in the development of M2b.We established RNAi cell line Kasumi-1and HL60 which will be the basis of our furtherworks.KEY WORDS: AML1-ETO, EEN (Extra Eleven Nineteen), fusion gene, acute leukemia,transcriptional factor, RNA interference6 上海交通大学博士

20、学位论文引 言在人类的急性髓系白血病中（acutemyeloidleukemia，AML），涉及t(8;21) 的染色体易位是至今发现的最频繁的染色体易位(1-3)。t(8;21) （q22；q22）易位导致的白血病占大约40% M2型AML 和全部初发AML的12%。在t(8;21)易位中，21号染色体上的AML1 基因的N端与8号染色体上的ETO基因的C端融合在一起，形成了一个具有异常转录活性的融合蛋白AML1-ETO(4)，导致白血病的发生。AML1（RUNX1, PEBP2B, CBF2）在造血细胞中表达较高，是造血系统非常重要的转录因子，调控着众多造血相关因子的表达。AML1属于RU

21、NX （PEBP2，corebindingfactorprotein，AML）家族，该家族成员还有AML2(RUNX3,PEBP2C,CBF3)和 AML3 (RUNX2, PEBP2A, CBF1)。所有的RUNX蛋白都具有DNA结合结构域runt，该结构域与果蝇的分节基因runt有同源性。AML2主要在成骨细胞、软骨细胞及骨基质中发挥重要作用，AML3则在胃上皮细胞调控中发挥重要作用。AML1在1991年被克隆发现(5)，对早期造血十分重要。除了具有DNA结合结构域runt，AML1还具有具有转录激活结构域(6;7)。与CBFb形成异二聚体后，AML1与DNA结合的能力增强(8)，AML1

22、/CBF复合物是维持正常造血的关键转录调控因子(9)。AML1基因敲除的小鼠胚胎因贫血、出血而死亡，其造血祖细胞数目缺如或显著减少，导致成熟血细胞数目显著降低(10)。这说明AML1具有促进造血干/祖细胞分化成熟的作用。AML1还可以抑制p21Waf1/Cip1的转录(11)，p21能抑制CDK的活性，推测p21 受抑后CDK活性升高，细胞周期素被Waf1/Cip1 Waf1/Cip1激活；同时AML1还可刺激细胞周期素D3的表达(12)。以上作用可缩短G1期时间，使细胞加速进入S期，与AML1 促进造血干/祖细胞的分化成熟有关。ETO基因（eight7 上海交通大学博士学位论文twenty

23、one，又被称为Myeloid Tumor Gene 8，MTG8），1993年被克隆于8号染色体脆点区。有两种转录本，均定位于核内，ETO在脑组织中高表达，在造血细胞中表达较低，具体功能尚不清楚。ETO家族还有两个成员：MTGR1(myeloidtransforminggenerelated protein-1) 和MTG16 (myeloid transforming gene chromosome16)(13-15)。在基因结构上， AML1-ETO蛋白包含AML1的1178aa和ETO的31604aa，定位于细胞核。该融合蛋白保留了AML1与DNA结合的Runt结构域，可以与CBF形成

24、异二聚体（heterodimer），而ETO蛋白在AML1-ETO中几乎保持完整，保留了大部分的结构域，仅仅缺少了N端的30个氨基酸。AML1-ETO结合AML1的靶基因序列后，许多被AML1激活的基因被AML1-ETO所抑制，以显著负性作用干扰AML1的功能，抑制造血干/祖细胞的分化成熟。这是t（8；21）导致白血病发生中的一个重要机制，其中AML1/ETO与N-CoR/mSin3/HDAC结合而抑制AML1的靶基因的转录，在AML1/ETO阻碍AML1功能中发挥重要作用(16-19)。AML1-ETO作为异常的转录因子的下游的靶基因相继报道，本课题的主要目的就是研究AML1-ETO异常调控

25、EEN基因的表达，阐明受到异常调变的EEN基因在AML1-ETO相关白血病中的作用。在直接调控下游靶基因时，AML1可以识别并结合到这些靶基因的启动子区的共有序列（core enhancer sequence）TGT/CGGT，籍此来调控这些基因的表达(20)。但是，主要扮演以转录抑制物出现的AML1-ETO 融合蛋白却通过结合到共有序列抑制了这些基因的表达。此外，有一些基因却不受正常生理蛋白AML1的调控，而特异的受AML1-ETO 融合蛋白的调控，如Bcl2(21)， TIS11b(22)and G-CSF(23)等。这反映了AML1-ETO 融合蛋白具有的获得性的功能突变（gain-of

26、-function）。直至今日，关于AML1-ETO的靶基因在白血病发生过程中的具体功能仍然不很清楚。EEN 基因是上海血液学研究所与香港大学病理系合作，在一例含 t （11；19）8 上海交通大学博士学位论文（q23； p13）易位的急性单核细胞白血病病人中首次克隆的(24)。在该易位中，位于19p13 的EEN基因与位于11q23的MLL 基因(myeloid-lymphoid leukemia，MLL)形成 MLL-EEN 融合基因。涉及 MLL 基因的染色体易位也是急性白血病中较为常见的核型异常，约占全部急性淋巴细胞性白血病（ALL）的10，占全部急性髓性白血病（AML）的 5。尤其是

27、在婴儿急性白血病和治疗相关性白血病(therapy-relatedleukemia，TRL)(25-27)。和MLL基因相关的染色体易位众多，到目前为止，已经发现了涉及 11q23 的多达 87 个染色体异常，其中，已经克隆到了 51 个相应的融合伙伴基因（fusion partner genes，FPGs），而且所产生的融合基因都保留着原来的读码框(28;29)(图1)。在这些易位分子事件中，MLL基因断裂于8.3kb 的BCR区，并在融合以后和 FPGs 的读码框保持一致。这些融合蛋白的产生导致了白血病的发生(30)。EEN基因属于含有SH3 结构域的蛋白家族，和融合基因MLL-EEN同样

28、在白血病的发生过程中发挥了重要的作用(31)。EEN 的具体的生理作用不很清楚。早先，有报道称EEN 和细胞内吞及某些信号转导通路相关。EEN 可以结合一些内吞蛋白（endocyticproteins），譬如synaptojanin、发动蛋白（dynamin）和amphiphysin，这些蛋白在突触小泡的转运中发挥作用(32-34)。EEN 还可以结合G蛋白耦联的1肾上腺素受体(35)。而且，有报道称EEN 还可以通过与电压门控性Ca 通道相互作用，2+从而在突触小泡的内吞过程中发挥关键的作用(36)。通过与BPGAP1 结合，EEN参与了EGF受体介导的内吞的激活以及ERK1/2 信号途径(

29、37)。EEN还通过其结合伙伴蛋白EBP（EEN binding protein）参与了Ras 信号途径和细胞转化(38)。尽管已经有了这些研究结果， 当时EEN在造血细胞中的作用以及肿瘤发生中的作用依然不甚明了。而且，有趣的是，EEN是其蛋白家族中唯一在造血细胞中表达的基因(24)。9 上海交通大学博士学位论文在MLL-EEN融合蛋白中，保留了大部分的EEN蛋白。而且，相关的研究表明，MLL基因的融合伙伴基因对MLL融合基因的致白血病作用是必须的(30)，而缺失了融合伙伴的截短型MLL蛋白则没有转化能力。这说明，融合伙伴EEN在白血病发生中具有重要作用。在本研究中，我们首先利用RT-PCR筛

30、选了不同细胞株中EEN的表达情况。发现EEN在Kasumi-1细胞中的表达比其他髓系或淋系细胞株有明显的升高。Kasumi-1细胞具有t（8；21）核型异常，融合基因AML1-ETO是显著特点(39)。于是我们比较了携带不同融合基因的白血病患者骨髓cDNA中EEN的表达量。发现具有AML1-ETO融合基因的M2b患者的EEN的表达量也有上调。继而，在松甾酮A （Ponasterone A，PA）诱导表达AML1-ETO的U937细胞株中，通过RT-PCR和Western证实，EEN的RNA和蛋白质水平都随着AML1-ETO的诱导表达而升高。为了研究AML1-ETO与EEN之间的调控关系以及在白

31、血病发生过程中的作用，我们分析了EEN基因的启动子和相关的转录调控机制。我们首先利用RNA酶保护试验确定了EEN基因的转录起始位点，该起始位点位于ATG起始密码子上游144bp处。通过对EEN启动子区可能的转录元件分析，找到了Sp1和一个AML1的潜在的结合位点（TGCGGT）。随后，我们利用染色质免疫共沉淀证实AML1-ETO可以通过这一结合位点与EEN的启动子结合。通过这一结合，AML1-ETO可以异常激活EEN基因的转录，而AML1则没有这个作用。由于过表达的AML1不具有激活EEN基因的功能，所以，说明其他的转录因子对EEN的表达发挥了主要作用。这样我们通过EMSA和转录报告试验研究了

32、Sp1对EEN基因的调控，证实Sp1可以结合到EEN的启动子区，并显著激活EEN基因的转录。EEN基因在染色体上与CAF1基因呈头对头的排列方式，所以，AML1-ETO可能可以调变CAF1基因的转录。我们发现，Sp1的结合位点序列与已知的绝缘子序列具有10 上海交通大学博士学位论文同源性。我们将该序列插入SV40的启动子和增强子之间，通过报告试验证实该序列在EEN基因方向上，可以激活EEN基因的转录。而在CAF1基因方向上，该位点具有阻断AML1-ETO对CAF1基因的转录激活作用，发挥绝缘子的作用。RT-PCR的结果也显示，在松甾酮A（PonasteroneA，PA）诱导表达AML1-ETO

33、的U937细胞株中，CAF1基因的表达与AML1-ETO的含量没有具体时相联系。这说明，该绝缘子在体内具有活性。同时，在该诱导表达体系中，Sp1蛋白的含量没有明显的变化。同时，我们研究了EEN基因的肿瘤转化能力，高表达EEN基因的稳转细胞株HL60增殖能力增加，高表达EEN基因的稳转细胞株NIH-3T3注射于裸鼠皮下可以导致肿瘤。初步的分子机制的研究表明，EEN能够增强原癌基因AP-1的活性。这提示，EEN的高表达的分子机制可能是通过激活AP-1途径来发挥作用的。为了进一步研究EEN在M2b白血病发生中的作用，我们还逐步建立了RNA干扰的Kasumi-1和HL60稳定转染细胞模型，为进一步的工

34、作打下了良好的基础。11 上海交通大学博士学位论文(According to C Meyer et al, Leukemia. 2006 Mar 2; Epub ahead of print)Figure1. Molecular-characterized translocation partner genes of the human MLLgene(28). Introns (type 0:white; type 1:red; type 2:blue), Red flashes (translocation site).Light gray boxes (non-translated re

35、gions). TLtranslocation; Insinsertion; Deldeletion;Invinversion; Splspliced fusion. 图 1MLL的基因 组结构和已知的易位伙伴基12 上海交通大学博士学位论文材 料 与 方 法一、EEN基因转录起始位点的确定1.1 构建用于 RPA分析的质粒 pBS-EENP以限制性内切酶 Apa I 和 Sac II切下包含 EEN基因第一个外显子的 392bp的基因组 DNA片段（-309 +83，以起始密码子的 A为+1），装入载体 pBlueScript SK中，构建用于 RPA分析的质粒 pBS-EENP，如图 2。

36、Figure2.The sequence of EEN promoter in the plasmid pBS-EENP图外2pBS-EENP质粒中EENP的序列ATG为EEN基因的起始密码子，下划线部分为EEN基因起的第一点个显子（部分）；CCGCGG、GGGCCC分别为SacII与ApaI的酶切位点；T3、T7为转录始位。1.2. RNA酶保护试验（RNase Protection Assay）用 RPA Starter Package（Pharmingen）试剂盒进行 PRA(40)。同时用 T7Sequencing Kit（Amersham Biosciences）进行测序反应(41)

37、，模板为 M13mp18 单链DNA，引物序列为5-GTAAAACGACGGCCAGT-3。测序反应产物与RPA产物一起进行PAGE，作为片段长度的参照。二EEN启动子的功能区段分析13 上海交通大学博士学位论文2.1.构建含EEN启动子的报告质粒pGL3-Basic（图3）Table 1. Primers for promoter of EEN gene amplification（注：引物合成由赛百盛、申友、博亚等公司合成，下同）Region PrimernamePrimer sequenceAmplicon(bp)126NucleotidenumberingEENP1EENP2EENP3

38、EENP4EENP5EENP6EENP7EP-f1EP-f2EP-f3EP-f4EP-f5EP-f6EP-f7EP-r5ATTGGTACCGGAAGCGTGCGGTTG35AAGGGTACCCAATGTGCACGTGC35TTGGGTACCCTCCACGACTCCAGG 35CCCGGTACCTGAAGAATCGTAAGCAG35ATGGGTACCAAGCAAGACTCCGTCTC35AATGGTACCTGGGAGGCTGAGGC35CTCGGTACCAGCCTGGCCAAC3-57+67222-155+67-248+67-336+67-439+67-530+67-621+6731540350

39、65976885TTTCTCGAGCTCAGCAGTCCCCGTCG3Fig3 The inset of EEN promoter into the vector pGL3-Basic图3pGL3-Basic质粒示意图根据EEN基因的转录起始位点，用PCR的方法扩增出不同长度的EEN启动子序列。14 上海交通大学博士学位论文引物序列见表1。以转录起始位点为+1，各突变体对应的序列分别为从59， -155，-248， -336， -439， -530， -621到 +67，分别命名为EENP17（图4）。这些不同长度的EEN启动子序列经内切酶KpnI和XhoI酶切后，克隆到pGL3-Basic载

40、体（图3）(Promega，USA)，分别命名为PGBEENP17，测序鉴定。以QIAGENPlasmidMidiPurification Kit （QIAGEN GmbH） 纯化质粒PGB-EENP17。Fig4 Different range of EEN promoter constructs图4EEN启动子各突变体示意图2.2.瞬时转染HL60与Cos7细胞1). 以含10% 胎牛血清 （FBS， Gibco BRL Life Technologies）的PRMI-1640培养液培养HL60细胞，以含10% 胎牛血清的DMEM培养液培养Cos7细胞。37，5二氧化碳培养箱培养。培养基中

41、添加，2 mML-glutamine，100 U/mlpenicillin，和 100 g/ml streptomycin。2). 瞬时转染HL60：HL60细胞悬浮于PBS，细胞密度调整为110细胞/ml，取7800l细胞到1.5 ml Eppendorf离心管中，加入10 g PGB-EENP17报告质粒，2015 上海交通大学博士学位论文ng pRL-TK内参质粒，混匀，室温孵育10分钟后，转移到Gene Pulser Cuvette电转杯（0.4cmelectrodegap，BioRad），在GenePulser电穿孔仪（Bio-RadLaboratories，Hercules，CA，

42、USA）上转染，按Gene Pulser Electroprotocol（BioRad）提供的条件（HL60：电压300V，电容500F）进行转染。转染后，转移细胞至6孔培养板中培养，避免吸出成团的死细胞，补加3 ml培养基。3). 瞬时转染 Cos7 细胞：取对数生长期的 Cos7 细胞，细胞融合度达到 7080时，用SuperFect Transfection Reagent （QIAGEN）转染NIH3T3细胞，操作按试剂说明书进行。将质粒加入无血清的 OptiMEM 培养基（Gibco BRL LifeTechnologies），与superfect reagent吹打混匀。室温下孵育

43、10 min。加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，混匀后加入细胞中37培养。3 h后换常规培养液，继续培养。2.3.荧光素酶活性测定（Luciferase Reporter assay）转染36小时后，贴壁细胞去上清，每孔125l被动裂解液Cos7直接用PassiveLysisBuffer加入培养板进行裂解。悬浮细胞离心收集后再用PassiveLysisBuffer进行裂解。细胞裂解上清用Dual-Luciferase Reporter assay system 在 Lumat LB9507 luminometer上进行荧光素酶活性的测定。（PLB），室温轻摇 15 分钟，取裂解物 1000

44、0g 离心 1 分钟，取上清按说明书用Dual-lucifrase 试剂盒（Promega）检测荧光素酶活性，以未作转染的孔作本底加以扣除，以海肾荧光素酶活性为内对照计算萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性比值。16 上海交通大学博士学位论文三转录因子Sp1对EEN启动子的活性的影响3.1. Sp1全长基因的克隆和表达载体的构建我们用 RT-PCR 的方法 得到了 Sp1 基因的 cds 序列(Acession number:NM_138473) ， 引 物 序 列 为 ： Sp1-f: gaatccATGAGCGACCAAGATCACTC ； Sp1-r:ctcgagtgcctgatcTCA

45、GAAGCCATTG。构建到pGEMT Easy vector（Promega）中以后，用内切酶EcoRI和XhoI切下Sp1，然后分别克隆到原核表达载体pGEX-4T3(42)和真核表达载体pCI（Promega）中，同时确保表达读框的正确性（in-frame）。酶切和测序鉴定上述构建的正确性。3.2. 突变质粒构建我们注意到在EEN启动子59-155部分有一段50bp的GC高度富含区（图4下划线处），通过生物信息学分析，我们发现这段GC序列包含了若干个Sp1的潜在的结合位点。同时，我们构建了缺失这一段GC序列的EEN启动子的构建，用来验证这一段GC序列的转录激活的功能。我们将含有EEN基因

46、promoter的构建pGB-EENP7中的Sp1结合位点用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）进行这一段GC序列的缺失突变(Stratagene)，使EEN启动子缺乏这一段潜在的Sp1结合位点。突变引物为：dGC-1 GCGTGCGCAGAaagcttCGGAAGCGTGC；dGC-2GCACGCTTCCGaagcttTCTGCGCACGC。突变质粒构建命名为pGB-EENP7-dGC。3.3. Sp1原核蛋白的表达和凝胶迁移实验将质粒pGEX-4T3Sp1转化到E.coli BL21原核蛋白的表达宿主中，在IPTG的诱导下

47、表达出与 GST 融合的 Sp1 蛋白，超声裂解菌体后，于 PBS (plus 1% TritonX-100 ， 5 mM DDT ， 100 g/ml PMSF) 中 与 含 有 谷 胱 甘 肽 的 珠 子17 上海交通大学博士学位论文Glutathione-Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech)孵育40分钟，4C，PBS洗涤两次。纯化好的原核蛋白经洗脱液洗脱，跑SDS-PAGE后，经CoomassieBrilliantBlueR-250 染液染色2小时后确定蛋白浓度。GST融合蛋白保存于-80或直接用于凝胶迁移实验（Gel Shift）。凝胶迁移

48、实验又被称为电泳流动迁移检测（Electrophoretic mobility shiftassay，EMSA）。凝胶迁移实验使用的试剂盒为DIGGelShiftKit(RocheDiagnostic，Mannheim， Germany)。探针为EEN启动子60-107bp区段，以DIG标记。3.4. 瞬时转染Cos7细胞和荧光素酶活性测定具体操作过程参考（2.2，2.3）我们分别将含有EEN基因启动子区的构建pGB-EENP7与突变掉GC序列的EEN启动子的构建pGB-EENP7-dG与Sp1的真核表达构建pCISp1共转染Cos7细胞，转染48 小时后，用 Passive Lysis Bu

49、ffer 裂解并进行荧光素酶活性的测定。（图 10）。pCISp1用量为每孔100ng；pGB-EENP7或pGB-EENP7-dG的用量分别为0ng、100ng、250ng、500ng。设三复孔，并重复一次试验。四 EEN启动子区绝缘子样顺式元件（Insulator-like element）的功能分析4.1.逆转录PCRTable 2. Primers for RT-PCRRegionPrimerforwardreverseforwardPrimer sequenceEEN5CAGCTGGTCAGTGAGAAGGTC35GCCGGCATCCAGCAATGCGTC35AACGACAAGTTG

50、GCATTTCC 3CAF118 上海交通大学博士学位论文reverseforwardreverseforwardreverseforwardreverse5CATAGGCACCTTCCCTTTGA35CCTGCACCACCAACTGCTTA35GCCTGCTTCACCACCTTCTT3GAPDHSV405TGAGGTACCATGGAGCGGAGAATG35TAACTCGAGGCTGTGGAATGTGTGTC35GTTGTGATGCGTATCCCCGTAG 35CTGGTTCTTGGAGCTCCTTGAG 3AML1-ETO培养Kasumi-1，HL60，U937，NB4，Jurkat，Nam

51、alwa和Raji等细胞，分别取17细胞抽提RNA。使用TrizolLSReagent(Invitrogen，Carlsbad，CA)抽提总RNA，10紫外分光光度计定量，甲醛变性胶电泳鉴定质量。经DNase I消化去除基因组DNA。取1g RNA使用SuperScript first-strand synthesis system (Invitrogen)和随即引物逆转录成cDNA。以所得cDNA行PCR，以GAPDH做内参。1琼脂糖电泳检测。4.2. 生物信息学分析和绝缘子（Insulator）序列的构建Figure 5 The alignment of known insulators

52、mycFV: chicken c-myc insulator；Ap: human amyloid protein insulator；lys: chicken lysozyme insulator；FII: chicken b globin insulator图5已知的绝缘子序列比对黑色阴影显示的是完全一致的氨基酸残基通过生物信息学分析，我们发现 EEN 启动子中60-107bp 的 GC 富含区段（即Sp1 结合序列）与其它若干个已知的绝缘子的序列有较高的相似性（图 5）。然后将19 上海交通大学博士学位论文该序列以双向插入 SV40 增强子和 SV40 启动子之间的报告载体 pGL3-Pr

53、omoter 中，见图7。首先合成oligoDNA:Ins-oligo1：GATCCCGGGGGCGCGCGCGGGGGCCGGGGGCGCGCGCGGGGGCCGGCAIns-oligo4：AATTTGCCGGCCCCCGCGCGCGCCCCCGGCCCCCGCGCGCGCCCCCGG95 5分钟，退火形成5为EcoR I半位点，3为BamH I半位点的双链片断，方向为反向：5-AATTTGCCGGCCCCCGCGCGCGCCCCCGGCCCCCGCGCGCGCCCCCGG-33-ACGGCCGGGGGCGCGCGCGGGGGCCGGGGGCGCGCGCGGGGGCCCTAG-5然后，插入载体pBlueScript II SK中，EcoR I和BamH I位点之间。（EcoRI位点被破坏，BamHI位点保留）。命名为pBS-Ins(-)，经T7引物测序验证。Figure 6 The diagram of pBluescript II SK Multiple Cloning Site Region图6 pBluescript II SK载体多克隆位点示意图 其中KpnI和XhoI位点之间插入了SV40 增强子，EcoR I和BamH I之间插入了双向的绝缘子序列随后从载体pGL3-Control中扩增SV40 增强子，引物见表2。