Asia-1型犬瘟热病毒分离株H蛋白免疫原性分析及重组犬腺病毒2型的构建.doc

1、 东北农业大学硕士学位论文Asia-1型犬瘟热病毒分离株H蛋白免疫原性分析及重组犬腺病毒2型的构建姓名：葛艳华申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：曲连东20090609 摘要摘 要犬瘟热 (Canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒 (Canine distemper virus，CDV)感染引起的犬及其他肉食动物的一种急性或亚急性、高度接触性传染性疾病，是我国当前对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一。常规弱毒疫苗虽然在 CD防控中发挥了非常重要的作用，但是也存在诸多缺点。加之犬瘟热病毒对流行因素的逐渐适应以及大量变异株的出现，全球范围内，犬瘟热的感染

2、呈上升趋势，且其中有很多是免疫群体爆发犬瘟热的报道。因此，有必要寻求更加安全、有效的影响新型疫苗。本研究首先对 Asia-1型犬瘟热病毒分离株 (HLJ2-07株)优势保护性抗原基因H蛋白基因进行了序列测定、遗传进化分析、真核表达和重组质粒 DNA的小鼠免疫试验，初步验证其免疫原性。并在此基础上把 H基因定向克隆入本实验室已构建完成的通用转移载体 pUC-E3-EGFP中，构建了含有犬瘟热病毒 H基因的转移载体 pUC-2E3-H。对实验室已构建的表达绿色荧光蛋白的重组犬腺病毒 2型 rCAV-E3-EGFP进行了蚀斑筛选、纯化和 PCR鉴定，对纯化完全的病毒进一步进行了生物学特性分析（形态学

3、鉴定、重组病毒与亲本毒株的病毒滴度比较、生长特性分析、遗传稳定性分析）。最后以转移载体 pUC-2E3-H转染 rCAV-E3-EGFP感染的 COS-7细胞，经体内同源重组，获得了表达犬瘟热病毒 H蛋白的重组犬腺病毒 2型 rCAV-2E3-H。序列测定结果显示：H基因全长 1824 bp，编码 607个氨基酸，含有 9个潜在的 N-联糖基化位点和 12个半胱氨酸残基。同源性分析表明：CDV HLJ2-07株与 Onderstepoort、Convac疫苗株亲缘关系最远，核苷酸同源性仅为 91.4%和 91.3%；系统进化分析显示：HLJ2-07株属Asia-1型；与 32株中国分离株比对，

4、显示目前国内大部分分离株属于 Asia-1型。由此，一方面说明，基因型的改变可能是 H蛋白抗原性变化的一个重要原因。另一方面，显示出从国内主要流行株中选取合适毒株，构建疫苗的必要性和必需性。H蛋白的真核表达及免疫原性分析结果显示：pcDNA3.1-H免疫组血清可与感染已知 HLJ2-07株病毒的 MDCK-SLAM细胞发生特异性 IPMA反应，染色后使细胞呈现阳性的棕红色，证明免疫动物后可产生抗 CDV抗体；ELISA血清抗体滴度可达 1：281：79；病毒中和抗体可达 1：111:32，表明 H蛋白具有免疫原性。重组病毒 rCAV-E3-EGFP的感染 MDCK细胞后，待出现 90%以上细胞

5、病变时收获病毒，经数次蚀斑筛选和纯化，PCR鉴定，最终达到纯化完全，生物学特性研究显示，EGFP基因的插入和 E3区的缺失不影响重组病毒的增殖特性，其毒力、生长特性与亲代病毒 CAV-2相似，保持原有疫苗株的生长特性，且在 MDCK细胞上连续传代 25代遗传性状稳定，显示出一定得应用前景。基于重组病毒 rCAV-E3-EGFP，我们经构建好的转移载体 pUC-2E3-H经纯化后用脂质体法转染感染了 rCAV-E3-EGFP的 COS-7细胞，病变明显时收毒，经蚀斑纯化和 PCR鉴定，获得重组病毒 rCAV-E3-H。通过 PCR、IFA鉴定，重组病毒能表达 CDV H蛋白。本研究在对本室分离的

6、犬瘟热病毒 HLJ2-07株 H基因进行了克隆及序列分析的基础上，进行了真核表达和免疫原性评估，纯化了表达 EGFP基因的重组病毒 rCAV-E3-EGFP，并在此基础上成功构建了表达 H蛋白的重组犬腺病毒 2型载体，为下一步的重组腺病毒在遗传稳定性、生长动力学及试验免疫研究奠定基础。I 东北农业大学农学硕士学位论文关 键词：犬瘟热；犬腺病毒 2型；重组病毒；H基因；真核表达；II AbstractImmunogenicity Analysis of H Protein of Asia-1Serotype Canine Distemper Virus and Construction ofRe

7、combinant Canine Adenovirus Type-2AbstractCanine distemper (CD) is an acute or subacute, highly contagious febrile disease in dogs and other camivorescaused by infection with canine distemper virus (CDV), and is one of the most severe diseases in canine farming, farcultivation and wildlife conservat

8、ion. Although conventional live modified vaccines are commercially available andplay an important role in controlling the occurrence of CD have several severe drawbacks. And with the changes ofenvironment and CDV adaptation to prevailing factors, new CDV variants, the number of typical CD cases hasi

9、ncreased throughout the world, and several episodes of CDV disease in vaccinated animals have been reported.Recently, it is very important to to develop new kinds of safe and efficient CDV genetically engineered vaccines.In the study, we cloned and sequenced the haemagglutinin (H) protein gene of As

10、ia-1 serotype CDV fieldisolate (HLJ2-07 strain), and constructed recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-H，which expressthe H gene fragment. We analyzed immunogenicity of expression products in vitro, and subsequently detectedimmune response in mice induced by DNA immunization. A transfer

11、 vector named as pUC-2E3-H wascongstructed based on the generated vector pUC-E3-EGFP with insertion of H gene. Recombinant virusrCAV-2E3-EGFP successfully constructed by our lab infected MDCK cells, and obtained afterseveral cycles of plaque purification and PCR identification, then we analysised it

12、s bionomics.Based on these, The transfer vector pUC-2E3-H was transfected into MDCK cells infected with rCAV-E3-EGFP by calcium phosphate-DNA coprecipitation method. The recombinant virus was selected by virus plaqueand identified by PCR, named rCAV-2E3-H.The results showed that the full length of H

13、 protein gene of HLJ2-07 strain was 1824 bp,which encoded 607 amino acids. There were nine potential N-glycosylation sites, and twelvecysteine residues. Homology analysis showed that the genetic relationship between HLJ2-07 andOnderstepoort (91.4 %), Convac (91.3 %)was the farthest of all. Phylogene

14、tic analysis showed thatHLJ2-07 belonged to Asia-1 type and its comparison with 32 strains CDV isolated in chinaindicated that most of them belonged to Asia-1 type. Alteration of gene type may be the importantreason of changing antigenicity of H protein. So it is necessary to find a proper stains in

15、 domesticto construct virus vaccine. The result showed that the sera of immunized goups could react withMDCK-SLAM infected by virus and had specifically bright red fluorescence. The titers of antibodyof ELISA and SN could relatively reach1:28-1:79 and 1：11-1:32. Three tests indicated that Hprotein h

16、ad the Immunogenicity. PCR, IFA, Western blot confirmed that recombinant virusIII 东北农业大学农学硕士学位论文rCAV-2E3-H could exress H protein whose molecular weight was about 84 kD. After therecombinant virus rCAV-E3-EGFP infected MDCK cells, when cytopathic effect was observedthe cells were frozen and thawed t

17、hree times, sonicated and centrifuged. The supernatant wasgenerated after several cycles of plaque purification and PCR identification. Compared to itsparental virus CAV-2, the recombinant virus rCAV-E3-EGFP showed no obvious differences invirus multiplication and growth kinetics in MDCK cells.After

18、 25 passages in MDCK cells , theEGFP gene was expressed stably in the recombinant virus rCAV-E3-EGFP, which was shown afront view of application. The transfer vector pUC-2E3-H was transfected into MDCK cellsinfected with rCAV- E3-EGFP by calcium phosphate-DNA coprecipitation method. Therecombinant v

19、irus was selected by virus plaque and identified by PCR, named rCAV-2E3-H.PCR, IFA, confirmed that recombinant virus rCAV-2E3-H could exress H protein.In this study, based on clone and sequence analysis of H gene of CDV HLJ2-07 strain, theImmunogenicity of H protein expressed in eukaryotic system wa

20、s analyzed. A recombinant virusrCAV-E3-EGFP expressing EGFP gene was generated after plaque purification and PCRidentification. The recombinant adenovirus vector expressing H protein was successfullyconstructed. All of these lay a foundation for the next studies of genetic stability, growth kinetics

21、and immunology.Key words: canine distemper virus; canine adenovirus type-2; recombinant virus; H gene; eukaryotic expression;Candidate: Ge Yan-huaSpeciality: Basic Veterinary MedicineSupervisor: Prof.Qu Lian-dongIV 研究生学位论文独创声明和使用授权书独创声 明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中

22、不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得(注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空 )或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位 论 文 版权使 用授 权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：日期：日期

23、：年月日年月日导师签名： 前言1 前言1.1 犬瘟热 的研 究进 展1.1.1 犬瘟热 病原犬瘟热 (canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒 (Canine distemper virus，CDV)引起的一种急性或亚急性、高度接触性传染病。该病传染性强，发病率高，临床症状多样，容易继发其他细菌、病毒的混合感染和二次感染 (蔡宝祥，1999)。其潜伏期随传染源的不同，长短不一，来源于同种动物，潜伏期约为 35 d；来源于异种动物，潜伏期可达 3060 d。随后出现双相型发热 (体温两次升高至 41以上)，眼、鼻急性卡他性或化脓性分泌物，在第二次发热时表现呕吐和腹泻，呼吸道有卡他性

24、炎症，病情渐趋恶化，有时发展为肺炎。临床表现包括：精神抑郁、体重减轻、脱水、皮肤有湿疹样病变或水泡和脓泡、鼻部和足垫过度角质化。神经症状一般在感染后 34周，全身症状好转后数天开始出现，表现为转圈、共济失调、肌肉痉挛、咬肌反复节律性颤动等。自然感染的幼龄动物多为急性、致死性经过，成年动物可呈慢性持续性感染 (殷震等，1997)。死亡率不定，在无并发症情况下，通常很少死亡；但约占 50 %的病例中，出现肺炎和脑炎的并发症，死亡率可上升到 7080 %(Anderson，1995；Appel and Summers，1995；Deem，2000；Hirama，2004)，是当前对养犬业、毛皮动物养

25、殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一。CD最早流行于欧洲大陆 (Blancou，2004)，于 1809年由 Jenner首次报道，被认定是一种细菌性疾病。直到 1905年，Carre等首次提出该病病原可能为一种病毒，可导致易感动物在发生感染后发生一种急性或亚急性、高度接触性、传染性、致热性疾病，表现为动物呼吸道、消化道和中枢神经系统异常 (Gillespie JH，1998)。之后的 20年间，仍有学者认为该病是由支气管败血波氏菌感染引发的。直到 1926年，Laidlaw和 Duncan利用经完全隔离饲养的犬及对 CD易感性和发生感染后死亡率最高的雪貂进行人工感染试验，从动物体内重新复制

26、出致病因子，最终确定了本病病原为一种病毒。1.1.2 犬瘟热 病毒 的生 物 学 特性CDV属于副粘病毒科麻疹病毒属，与麻疹病毒 (Measles virus，MV)、海豹瘟热病毒(Phocine distemper virus，PDV)、牛瘟病毒 (Rinderpest virus，RPV)、小反刍动物瘟疫病毒(Pestedes petits ruminants pestivirus，PPRV)、海豚瘟热病毒 (Porpoise morbillivirus，PMV)同属，与 MV和 RPV的亲缘关系最近，具有极为相似的抗原关系和分子生物学特征，特别是在超微形态和结构上几乎完全相同 (Lamb

27、 and Kolakofsky，1996)。目前已报道对 CDV敏感1 东北农业大学农学硕士学位论文的动物包括食肉目所有 8个科、偶蹄目猪科、灵长目猕猴属、鳍足目海豹科、鲸目海豚科等多种动物 (陆承平等， 1999)。此外，引起贝加尔湖海豹致死性感染的海豹瘟热病毒 2型(PDV-2)亦被认为是犬瘟热病毒 (Mamaey，1995)。伴随生态环境的改变、动物和病毒的进化和对流行因素的适应以及 CD诊断技术的日益成熟和进步，CDV自然感染宿主范围在不断扩大，陆续出现了大熊猫、猕猴、西湍等珍稀动物感染 CDV的报道。Mee等 (1993)从患慢性骨病-Pagets的病人骨细胞中检测出了 CDV的核酸

28、，以 CDV/MV特异性引物进行 RT-PCR，并进一步对 PCR产物测序分析，发现其序列与 CDV-Onderspoort毒株的碱基差异仅为 2%，并证实 CDV或其近缘病毒可在体外感染人的破骨细胞，定居于病人破骨细胞、成骨细胞和骨细胞内，推测病毒在病人骨细胞内的持续存在和增殖。加之曾有自然感染或人工感染 CDV的幼犬出现骨损伤的报道，这使得 CDV有可能成为由犬传播给人的第二个病毒性传染病的病原，不过尚需进一步研究才能得出结论 (Gordon，1992)。CDV病毒粒子呈多形性，多数为球形，亦有畸形和长丝状，直径为 110350 nm，蔗糖中的浮密度为 1.1801.218 g/cm3，峰

29、值为 1.195 g/cm3。病毒粒子中心含有宽径约 1517 nm的螺旋状核衣壳，成分为基因组 RNA和许多核衣壳蛋白亚单位，外覆由细胞膜和脂类衍生而来近似双层轮廓的囊膜，囊膜上排列有 1.3 nm的杆状纤突，纤突上只含血凝素，而无神经氨酸酶。CDV对环境的抵抗力不强，干燥的病毒在室温中尚稳定，在 32以上则易灭活，5060 1 h即可使病毒迅速灭活，24可存活数周，但感染力迅速丧失，在-10可生存几个月，在- 70或冻干条件下可长期存活；对热、干燥、紫外线和有机溶剂敏感，易被可见光、酒精、乙醚、甲醛和煤酚皂等灭活。病毒在 pH4. 5以上尚稳定，pH4. 5以下或 pH9. 0以上的酸碱环

30、境可使其迅速灭活，一般 pH 7. 0有利于病毒的保存 (殷震等，1997)。1.1.3 犬瘟热 病毒 的分 子 生 物 学 特性1.1.3.1 基 因 组结 构CDV为有囊膜、不分节、非重叠的单股负链 RNA病毒。全长 15616 nt，由不同的基因组组成，基因组 RNA本身不具有感染性，是转录和复制互补的 mRNA及 RNA中间体的模板。基因组呈线状排列，包括 6个分重叠基因区，其中 3端 55nt的前导序列和 5端 38nt的尾随序列为推测的启动调节序列，负责指导基因组的复制、转录及衣壳的形成过程。在两侧翼序列之间为各结构蛋白的编码基因，按 3- 5顺序依次为核衣壳蛋白 (nucleoc

31、apsid protein，N)基因 1683 nt、磷蛋白 (phospho protein，P)基因 1655 nt、基质膜蛋白 (matrix protein，M)基因 1442 nt、融合蛋白 (fusion protein，F)基因 2205 nt、血凝蛋白 (attachment protein orhemagglutinin protein，H)基因 1944-1946 nt、大蛋白 (large virus-specificied RNA directed RNApolymerase protein，L)基因 6573 nt，各结构基因上均有自己的 ORF，其中 P基因包含两个

32、部2 前言分重叠的 ORF，另外编码两个非结构蛋白 C和 V蛋白 (Curran MD，1992)。各 3端和 5端均为非编码区，特点是都均有一个半保守的 poly A、终止信号、非转录三联核苷酸标志 CUU。图 1-1 CDV基因组结构示意图Fig.1-1 The genome structure of CDV1.1.3.2 结 构 蛋 白 及 其 功 能CDV的结构基因分别编码 N、P、M、F、H和 L 6个结构蛋白，其中 P、N、L为芯髓蛋白，与 RNA的转录和复制有关。M、F、H为包被蛋白。N蛋白是形成核衣壳的主要蛋白，含量最多，起包裹和保护内部基因的作用，是主要的交叉抗原，在感染早期

33、的免疫应答过程中起主要作用。分子量为 58 kD，含一个 ORF，起始于 108110 nt位的 ATG，终止于 16771679 nt的 TAA，编码 523个氨基酸，从结构上可分为三个区，即可变区 N末端 (17159 aa)，可变区 C末端 (408519 aa)及高度保守区(160407 aa) (Yoshida E，1998)。Yoshida等 (1999)以 Onderstepoort疫苗株基因组为模板，研究 N蛋白抗原表位，证明其 180位和 337358位为主要抗原表位；且 180位还是 N蛋白从细胞质转运到细胞核所必需的。N蛋白在 281289位还具有 T细胞表位，在病毒侵染

34、时能诱发 MHC-类抗原限制性 CTL反应，在细胞免疫方面发挥重要作用 (Beaucerger P，1993；Steward MW，1999)。P蛋白属于糖基化蛋白，编码 507个氨基酸，与 N和 L蛋白一起组成核衣壳，具有聚合酶的活性。含一个 ORF，起始于 5961位的 AUG，因对蛋白水解作用敏感，SDS-PAGE电泳中呈不规则的泳动，所以分子量上常存在一定差异，如 Onderstepoort分子量 66 kD，Convac为 78 kD (Diallo等，1990)。另外，Curran等 (1992)发现在其 750位编码一个 V蛋白；而起始于 8284位、终止于 604606位，存在

35、另一个部分重叠的 ORF，编码非结构蛋白-C蛋白。V蛋白在功能上与 L蛋白发生反应，在 CDV快速入侵粘膜组织和淋巴器官的淋巴细胞的过程中起抑制细胞因子的传导，进而抑制病毒的复制的作用 (Palosaari，2003；Veronika，2007)而 C蛋白主要在 CDV入侵后的感染过程中起诱导宿主机体出皮疹反应 (Veronika，2007)。L蛋白 ORF起始于 23位的 ATG，编码 2161个氨基酸，分子量 246 kD，是副粘病毒中是最大的。L蛋白的主要结构特点包括具有高含量的 Leu和 Ile，存在一个线形、不连续的高度保守功能区。L蛋白被认为是一种多功能酶单位，它不但具有特异性 R

36、NA聚合酶活性，在3 东北农业大学农学硕士学位论文病毒 RNA形成的过程中也起到多种酶的作用，如：初级 mRNA转录本的加帽、聚腺苷化、甲基化及作为蛋白激酶 (Mohinderjit，1993)。6个保守区域中，第 3区在 7487位，存在一个保守的五肽结构 QGDND是模板识别和磷酸二脂键形成的活性位点。第 2区在 631650位，每间隔 4个 aa就存在一个碱性疏水 aa，构成 -螺旋结构，负责与 RNA模板结合。第 6区在19691937位，存在 GXXGXGK结构，与 L蛋白的聚腺昔酸化和蛋白激酶活性密切相关(Nishio et al，1996)。F蛋白为寡聚糖蛋白，位于囊膜表面，包括

37、附着区、融合区和穿膜区三个主要的功能区。以前体 F0 (分子量 62 kD)的形式被合成后，经胞内蛋白水解酶裂解为 F1 (40 kD)、F2 (23 kD)，二者再以二硫键相连，形成异种蛋白二聚体，此裂解过程一般认为是 F蛋白发挥融合活性所必需的。主要是在融合过程开始后通过构象的改变，F1的 N端暴露出一个高度保守的强疏水氨基酸序列融合序列，直接与宿主细胞膜作用，介导病毒囊膜与靶细胞膜之间的融合(Varsanyi，1987)。Von等 (2001)也在研究中明确了靠近膜的切割的发生和调节 F蛋白的功能。F蛋白是宿主免疫系统识别的主要把抗原蛋白，刺激宿主机体产生中和抗体，其诱导的免疫反应能阻止

38、病毒进一步侵染，并在病毒增殖时，抑制症状的发生，限制感染的传播和阻止致命性疾病的发生 (Erling，1986)。F蛋白也是异型免疫的主要交叉抗原，在麻疹病毒属 CDV、MV群特异性 T细胞和 B细胞表位分布于其 288302位和 404414位氨基酸残基处，构成嵌合多肽，诱导产生抗 MV和 CDV的保护性免疫应答 (Befwee，1986)。F蛋白具有两个重要的辅助性 T淋巴细胞表位，位置在 F1和 F2断裂位点附近，一个位于 F2片段的末端 148213位氨基酸残基处，另一个位于 F1N末端 212283位氨基酸残基处，推断可能是犬抗原提呈细胞 (APCs)最优先识别和提呈的位点。H蛋白基

39、因由 19441946个核苷酸组成，它的 mRNA的 5端 UTR含有 2022个核苷酸，3端 UTR则含有 105左右个核苷酸，在这两个区域内没有稳定的茎环结构，含一个 ORF，起始于 2123位的 ATG，Oderstepoort疫苗株终止于 18331835位的 TAA (Curran等，1991)；或 18421844位的 TGA，前者见于 Oderstepoort疫苗株，后者多见于野毒株 (Bolt等，1997；Carpenter等，1998；Haas等，1997；Iwatsuki等，1997)CDV、MV、RPV之间的H蛋白基因的同源性分析显示 CDV比 MV更早从 RPV中演化出

40、来独立成支 (Kovamees等，1991)。H蛋白是 II型糖蛋白，N末端的 3555位氨基酸 (Asia-1为 19个氨基酸残基构成；Asia-2为 20个氨基酸残基构成)形成 CDV H蛋白特有的疏水锚定区，作为穿膜的信号序列和锚定 H蛋白嵌在 M蛋白上。H蛋白容易发生抗原漂移，引起毒株毒力和抗原性的变异，其变异率在所有结构蛋白中最高 (变异率按从高至低顺序依次排列为 H、N、L、P、F、M) (Haas等，1997；Mochizuki等，1999；Iwatsuki，2000；Uema等，2005；Martella等，2006)。潜在的 N-联糖基化位点的不同可能直接影响病毒的抗原性，而

41、这种遗传变异很可能是近年来犬瘟热暴发的一个重要原因 (Pomeroy等，2008)。目前已知的 9个位点分别在 19-21、149-151、309-311、4 前言391-393、422-424、456-458、584-586、587-589和 603-605。而最常用的两疫苗株 Onderstepoort株和 Convac株的糖基化位点分别为 4个和 7个。目前了解的野毒株多为为 89个，其中Asi a- 1型一般为 9个，除 KDK- 1缺失 19- 21位外，鲜少看到缺失；Asi a- 2型如 007Lm、98- 002、26D、HM- 3等含有 8个，缺失 584- 586位。各毒株间

42、半胱氨酸残基 (Cys残基)相对保守，除CDV3有一处在 414位 (其它在 304位)，均含有 12个，分别位于 139、154、188、283、296、377、382、390、490、566、575、602位。另外，H蛋白存在许多中和性抗原表位，是诱导机体产生中和抗体的主要蛋白，在抗 CDV免疫中起着非常重要作用，Hirayama (2003)发现抗 H蛋白的单克隆抗体具有中和病毒的活性，对免疫小鼠可以产生比抗 F蛋白更好的保护力。此外，H蛋白至少含有一个细胞毒性T淋巴细胞表位，在小鼠和犬体内能诱发特异的 CTL活性 (Sixt et al，1998；Himma et al，2003)。H

43、蛋白在在感染初始，对于病毒自身和宿主都是非常重要的。一方面，病毒通过 H蛋白识别、吸附于细胞表面的 CD46或 CD150/SLAM受体 (Oldstone，2002；Yanagi，2002)、再与 F蛋白协同使病毒囊膜与宿主细胞膜发生融合，完成病毒感染的第一步；另一方面，宿主在此阶段同样针对 H蛋白产生免疫应答，阻止病毒的感染 (Greene，1998；Martella，2006)。Messing (2001)等为确证不同毒株融合效应的决定因子，选择了 5804Han89分离株、形成小和大蚀斑的 Onderstepoort疫苗株 (CDVos和 CDVoL)和 MV疫苗株 (MVEdm)，将

44、两个毒株的 H和 F蛋白进行组合混合感染 Vero细胞，观察细胞融合效应，结果表明 H基因是 CDV的细胞融合性、生长特性和细胞嗜性的主要决定蛋白。Nathalie (1998)以重组真核表达质粒 pVIJ-CDV-H和 pVIJ-CDV-F，分别采用肌肉注射和基因枪皮下免疫 BAlB/c母鼠，结果表明：两者组经肌肉注射和皮下基因枪注射，免疫小鼠均能产生高水平的 CDV特异性抗体，抗体水平均可持续 6个月。对致死剂量神经毒性 CDV的脑内攻击都能产生保护力，但 pVIJ-CDV-H的保护效果好于 pVIJ-CDV-F，且没有出现 pVIJ-CDV-F免疫组在攻毒后第 2周出现的肥胖症。Cher

45、pillod等 (2000)以 A75/17的 H和 F基因构建真核表达载体 PCI-H和 PCI-F，隔2周免疫小鼠，四免后 2周监测血清中和抗体。PCI-H和 PCI-F分别最高抗体滴度为 1：64和 1：16。M蛋白即非糖基化的囊膜糖蛋白，位于囊膜内层，3端具有 400nt URF，含一个 ORF，起始于 4345位 AUG，终止于 10481050位，编码 335个氨基酸，分子量为 34 kD，是病毒粒子中最小的和最保守的 (Sharma，1992)。脯氨酸和甘氨酸位置高度保守，起形成转角的作用 (Bellini，1986)。Wiley (1985)和 Peoples (1991)把

46、M蛋白的作用定义为，在装配和出芽过程中，参与囊膜的形成，介导核衣壳、胞质区与囊膜三者间的识别，与引起慢性、持续性感染有关。1.1.4 犬瘟热 的流 行及 犬瘟热 病毒 变异 的分 子 基 础CDV呈世界性分布，自然感染宿主范围不断扩大，且在大量不相关的动物物种中可以交5 东北农业大学农学硕士学位论文叉传播，给养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业都造成了严重的危害 (Harder等，1997)。尽管犬瘟热常规疫苗的广泛使用，使 CD的流行一度得到有效的控制 (Nochizuki，2006)。但近些年，CD的爆发呈越演越烈之势。1988年北欧沃顿海域海豹由于感染犬瘟热病毒大批死亡， 2002年该

47、海域再一次暴发海豹犬瘟热感染，总计至少 20000只海豹的死亡(Osterhaus，1988；Jensen，2002)。19911994年，美国伊利诺斯州、加利福尼亚州、旧金山三地的野生动物保护区，分别发生狮、虎、豹、土狼 CDV感染事件，造成超过一半的动物死亡；坦桑尼亚 Screnegeti国家公园仅 1994年死于 CD感染的狮子总数已超过 60只(Appel等，1994；Morell，1994，1996；Roelke-Parker，1996；Harder，1995，1996；Haas等，1996)。其它如日本在有无疫苗接种史的家犬和野生浣熊中都发生过 CD的流行 (Kai等，1993；G

48、emma等，1995；1996a，b)；与之相似，欧洲爆发 CD感染的报道也在不断增加 (Glardon等，1985；Blixenkrone等，1993，Blancou等，2004)。并且已证明犬瘟热不光感染陆栖动物，也感染水栖动物，如感染西伯利亚海豹 (Mamaev等，1995)。虽然存在个体免疫效果差异或疫苗免疫失败，但也不能排除新流行株发生变异导致 CD爆发的因素。许多研究者发现 CDV的爆发存在一定的地域性 (Martella，2006；Calderon，2007；Simon-Martinez，2007)。基于 H基因序列的同源性分析，CDV毒株一般分为 7个谱系：American-1

49、 (Vaccines)，American-2，Arctic-like，Asia-1，Asia-2，Europe，Europe wildlike(MeCarthy，2007)。Kiyoko等 (1997)对日本分离株 Ueno、Hamamatsu、和 Yanaka进行了序列分析，核苷酸同源性分析结果显示三者间同源率为 99 %，与欧美分离株间同源率为 95 %，与 Onderstepoort、Convac的同源性最低，仅为 90 %；均编码 607 aa，H蛋白分子量为 84 kD，区别于弱毒疫苗株 Onderstepoort的编码 604 aa，分子量 78 kD；有 9个潜在的 N-联糖基化

50、位点，而 Onderstepoort、Convac仅含 4个和 7个；系统进化分析表明三者均属于 Asia-1型。Pascal等 (1999)分析比较了瑞士 A75/17强毒株和 Onderstepoort疫苗株之间的生物学差别。两者在 H蛋白表达区存在 139个核苷酸差异，而这些差异又导致两者间 57 aa的差别。后者的翻译密码子 AUU在前者中被 UCA替换。而推导的氨基酸，由于 A75/17终止密码子比疫苗株远 3个密码子，编码 607 aa，有别于疫苗株的 604 aa。两者 N-联糖基化位点的个数为 7个和 4个。A75/17在传代过程中能引起永久性感染而 Onderstepoort

51、株呈裂解性感染。CDV虽然只有一个血清型，但各毒株在毒力、宿主范围、培养特性等均表现出一定差异，以此推测其基因具有多样性。目前常见的疫苗株均由美国-1谱系的分离株制备，主要有 SnyderHill、Lederle、Convac、Rockbom、Onderstepoort，其中 Snyder Hill株，在 1950年从犬的大脑中分离，以犬脑继代五代后再接种犬，能使 95%的犬发生脑炎症状，而 Onderstepoort株是导致 1930年在美国大农场中的狐狸爆发的病员。分子流行病学对 CDV毒株的起源追溯，调查各种毒株在易感动物中循环的动力学研究是有用的。但是不幸的是，缺少普通标准株和调查 C

52、DV的标准指南，不能形成中确的有价值的评估这种病原的流行特点，以前的研究针对不同的基因位置。对不同区域的不同动物来源的 CDV毒株序列分析显示在 H糖蛋白基因中6 前言存在基因/抗原漂移，与流行毒株的地理学位置相关，依据地理学模式。另外，H基因是可靠的目标用于调查 CDV相关毒株之间的亲缘关系。另外，类似 CDV疫苗的病员在田间爆发但他们仅在犬中报道。此外，北极株早期认为仅存在在北极生态系，最近在美国、欧洲均有报道，对这些罕见的毒株存在争议。推测原因，是由于不受控制的动物交易，是 CDV流行的变化，导致新毒株在无该病原或免疫控制地区的首次爆发。1.2 犬瘟热 疫苗 研究进 展CDV呈世界性分布

53、，自然感染宿主范围不断扩大，且在大量不相关的动物物种中可以交叉传播，给养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业都造成了严重的危害。由于 CD没有特效的治疗药物，免疫接种是预防和控制该病的主要措施 (Chappuis，1995)。在犬瘟热的防治过程中，现有的常规疫苗，虽然在控制该病的发生上起到一定作用，但越来越多的数据显示 CDV目前的主要流行株尤其是来源于不同地区或国家的分离株和 Onderstepoort、Convac等疫苗株在抗原性、引起的细胞病变类型、毒力、遗传特性、引起的临床症状等方面存在一定的差异，所以以 CDV疫苗株制备的疫苗完全不能保护动物免受异源毒株的感染，这无疑为 CD的有效预

54、防带来了困难。现对犬瘟热疫苗的发展过程介绍如下。1.2.1 常 规 疫苗 的研 究进 展1.2.1.1 灭活 苗有文献记载 CDV最早的主动免疫发生于 1923年，Puntoni的 CDV感染犬的脑组织经福尔马林灭活的 CDV苗 (Merete，1993)，后来发展到丙内酯、乙基乙烯酯、乙酰乙烯亚胺、二乙烯亚胺灭活的方法。灭活疫苗具有安全性强，不散毒造成 CDV新疫源，便于贮存和运输，能摆脱母源抗体的干扰等优点，对一些极易感的动物可以起到很好的保护和安全可靠效果，如接种灭活苗的海貂可免受 CDV致死性攻击。但论其缺点，其抗原性差，仅能激发机体产生低水平的体液免疫，对强毒攻击不能产生完全保护，需要反复多次免疫接种且效果不稳定，经常导致免疫失败。所以目前已基本被广泛使用的弱毒苗所取代。1.2.1.2 MV 疫苗鉴于 MV与 CDV两者之间密切的