分子排阻色谱法测定多糖分子量及其分布-梁翠荣.ppt

1、测定分子排除色谱分析法、多糖体的分子量及其分布、分离原理，凝胶渗透色谱分析法Gel Permeation Chromatography GPC又称体积排除色谱分析法Size Exclusion Chromatography SEC， 测定的高分子溶液内置不同孔径的柱，柱中的分子能够通过的路径是粒子间的聚合物溶液在柱中流动时，大分子物质由于直径大，难以进入凝胶粒子的细孔，只能分布粒子之间，所以洗脱时的移动速度快(即保持时间短)。 小分子物质除了能扩散到凝胶粒子的缝隙之外，还能进入凝胶粒子的细孔，洗脱时的移动速度相当慢(即保持时间长)。 经过一定长度的柱，分子被相对分子的大小分离，这种现象称为分子

2、筛效应。 测定方法、直接法：在测定淋浴液浓度的同时，测定其黏性系数和光散射，求出其分子量。 间接法：以一组分子量不同的单分散样品为标准样品，测定各润湿体积(保持时间)，建立保持时间与分子量的关系，求出其分子量。 间接法、右旋糖酐分子量对照品(供右旋糖酐分子量测定用中检所使用)右旋糖酐分子量D1 M 2500； 右旋糖酸无水物分子量D2 M 4600； 右旋糖酸无水物分子量D3 M 7100； 右旋糖酸无水物分子量D4 M 10000； 右旋糖酸无水物分子量D5 M 21400； 右旋糖酸无水物分子量D6 M 41100； 右旋糖酸无水物分子量D7 M 84400； 右旋糖酸无水物分子量D8 M

3、 133800； 右旋糖酐分子量D0 M 180； 右旋糖酐分子量D2000 M 2000000，校准原理采用已知的相对分子量的单分散标准聚合物构成了淋浴体积或淋浴时间与相对分子量的对应关系曲线，称为“校准曲线”。 在聚合物中几乎没有发现单分散的标准试料，被狭小分布的试料替换。 在相同的测试条件下，制作一系列的GPC标准光谱，用重均分子量的对数值(lgM )绘制保持时间(t )，得到的曲线是“校正曲线”。 通过校正曲线，可以从GPC光谱中校正各种所需的相对分子量和相对分子量分布的信息。色谱柱各种色谱柱的孔径分布有一定范围，有最大极限和最小极限。 如果分子大小大于凝胶的最大细孔径，则全部排出凝胶

4、粒子外，这被称为全排出阻力。 两种全排阻的分子即使大小不同也没有分离效果。 小于凝胶最小孔径的分子可进入凝胶的全孔。 如果两个分子都进入凝胶的细孔，那么即使它们的大小有差异也没有好的分离效果。 因此，柱具有一定的使用范围。 使柱的亲水性球状高分子化合物为填充剂(TSK G PWXL柱、Shodex OHpak SB HQ柱)右旋糖酸无水物铁元素TSK G2500 PWXL右旋糖酸无水物20 TSK G3000 PWXL右旋糖酸无水物40 TSK G4000 PWXL右旋糖酸无水物70 TSK G4000 PWXL。 通过连续测定淋浴液折光率的变化来测定试料的浓度，只要溶剂的折光率与被测试料的折

5、光率不同就可以进行检测。 测定方法提取库托格拉夫条件和系统适应性试验TSK G PWXL柱温度35试样量20l流动相： 0.71%硫酸纳米金属钍溶液(含0.02%叠氮化钠) 0.5ml/min葡萄糖和右旋糖酐2000，分别加入流动相，制备10mg/ml的溶液， 取试料的对照品溶液：取右旋糖酐分子量对照品(中检所)适量，分别加入流动相，制成10mg/ml的溶液，在室温下放置一夜。 供试品溶液：取适量供试品，加入流动相制成10mg/ml的溶液，在室温下放置一晚。 测定法：取对照品溶液，取样品，用GPC软件修正回归公式。取出供试品溶液，用同法测定，用GPC软件计算供试品的重均分子量及分子量分布。 注意事项，1 .在连接柱之前，将在先中使用的流动相置换为即将使用之前的流动相，控制流动相的流速，注意不要成为超压(适用的压力范围说明书中有详细记载)。 2 .与通常的HPLC法一样，使用时过滤流动相和样品进行漂亮地。 3 .柱子之后用水冲洗，连接的检测器也冲洗。 不要把盐放在检