胚胎干细胞研究进展.ppt

1、人胚胎干细胞human embryonic stem cell,生殖医学国家重点实验室 周作民,干细胞的基本概念,一、定义： 具有自我复制(amplification)的能力，在一定条件下能够分化(differentiation)成各种功能细胞。,二、分类： 根据存在时间分： （1）胚胎干细胞 （ embryonic stem cell）, 具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型，进一步形成机体的任何组织和器官。,（2）成体干细胞 (adult stem cell)：位于成体组织和器官中的未分化细胞，具有分化成功能细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。起维持和修复其所在组织的

2、作用。,根据分化能力分： （1）全能干细胞：囊胚前的胚胎细胞 （2）多能干细胞（全能干细胞）：内细胞团细胞 （3）单能干细胞：成体干细胞,横向分化(转分化)： 部分成体干细胞在特定条件下可以转化为其它细胞,造血干细胞 神经细胞 骨骼肌细胞 心肌细胞 肝细胞 骨髓基质细胞 骨骼肌细胞 心肌细胞 神经干细胞 血细胞 骨骼肌细胞,人胚胎干细胞 human embryonic stem cell,一、人胚胎干细胞的定义: 人体早期发生过程： 精子+卵子 合子 卵裂球 桑椹胚 胚泡（囊胚）,滋养层胎儿附属结构 胚泡 囊胚腔 内细胞群胚盘胚体,内胚层 内细胞群胚盘 中胚层 外胚层 内胚层 消化道、呼吸道上

3、皮和腺体；肝；胆；胰。 中胚层 结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统 外胚层 体表结构；神经系统,胚胎干细胞： 发育早期位于囊胚内的具有全能性的内细胞群细胞。,永生化(immortal)； 有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化； 能维持稳定的二倍体染色体结构； 具有全能性；,二、人胚胎干细胞的特性,三、人胚胎干细胞建系,分离囊胚的内细胞群与成纤维细胞共培养，ES细胞非分化增殖 胚胎干细胞的鉴定定向诱导分化成体干细胞功能细胞,建系步骤： 获取早期发育的胚胎 分离囊胚的内细胞群 ES细胞体外培养，细胞非分化增殖 ES细胞的鉴定 ES的传代和冻存,1.获取早期发育的胚胎或ES样细胞： （1）正常

4、受精发育的囊胚，从中分离内细胞群细胞ES细胞 （2）体细胞核移植胚胎（somatic cell nuclear transfer, SCNT） （治疗性克隆） （3）孤雌增殖胚胎干细胞 (4）体细胞重编程(去分化) （5）其它： 从发育5-9周的胚胎生殖腺中分离出人的EG细胞（embryonic germinate cells） 恶性胚胎肿瘤或畸胎瘤细胞 （embryonic carcinoma, EC),正常受精发育来源的胚胎,2、胚胎干细胞的分离 机械分离法 酶消化法 免疫方法去处 滋养层细胞,3、人胚胎干细胞的培养： (1) 特殊的培养液：用DMEM培养液。 (2) 以人或胚鼠的成纤维细

5、胞为饲养细胞 (feed cell)。 (3) 必须加入LIF（leukemia inhibitory factor）， 抑制细胞分化。,4、胚胎干细胞的鉴别 （1）形态学观察 （2）细胞内酶活性检测 （3）特异表达基因检测 （4）表面标志物检测 （5）染色体检测 （6）细胞传代能力检测 （7）细胞分化能力检测,ES细胞的形态学观察 生长特点：呈集落样生长，单个细胞体积小而 圆，核质比大。,A-C：ES细胞集落 D：已分化的ES细胞,（2）细胞内酶活性检测 碱性磷酸酶(AKP)活性高 端粒酶活性高（telomerase activity),（3）特异基因表达检测 Oct4基因呈阳性表达,人、猴

6、、小鼠ES细胞的分子差异,（4）细胞表面标志物检测,AKP染色 B. SSEA-1 染色 C. SSEA-3染色 D. SSEA-4染色 E. TRA-1-6染色 E. TRA-1-8染色,细胞表面标志物检测,（5）染色体检测 （6）细胞传代能力检测,（7）细胞分化能力检测 接种裸鼠可形成畸胎瘤 体外可诱导成各种成体细胞,胚胎干细胞植入裸鼠皮下形成的畸胎瘤,A. 消化管 B. 神经组织 C. 骨组织 D. 软骨组织 E. 肌肉组织 F. 肾,5. 胚胎干细胞的传代和冷冻保存 目的： 获得较多的胚胎干细胞 防止胚胎干细胞的自发分化 维持细胞系的存在 方法： 当胚胎干细胞生长成较大的集落时就要传代

7、，将集落细胞消化成单细胞后续代培养。 采用含10%15%二甲基亚砜（DMSO）的ES细胞培养液 进行冷冻保存,四、胚胎干细胞的诱导分化 1. 常用的诱导方法 （1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质， 如VEGF、bFGF 、DMSO和RA等； （2）将ES细胞与特定的细胞共培养(co-culture) ； （3）将ES细胞移植到体内，利用局部环境诱导； （4）将某种分化诱导因子的基因转入ES细胞内。,2. 分化细胞的常用鉴定方法： （1）细胞形态与结构 （2）细胞功能 （3）细胞表面的特殊标志 （4）细胞内特异基因的表达,诱导成神经细胞 （1）RA诱导； （2）生长因子诱导：FGF2，FGF8

8、；GDNF；、NT、TGF-3和IL-1 （3）共培养法：与骨髓基质细胞共培养； （4）基因转染：Nurrl，bHLH，Mash1等； （5）体内移植；,红色细胞：神经元 绿色细胞：胶质细胞,胚胎干细胞脑内移植后分化为神经前体细胞（A图中红色细胞）和卫星细胞（B图中红色细胞）,诱导成胰岛素分泌细胞 （1）5步诱导法： ES类胚体巢蛋白（nestin)分泌细胞胰腺内分泌前体细胞胰岛素分泌细胞 3-磷酸肌醇-激酶抑制剂为重要的诱导剂 （2）基因转染：胰岛细胞分化相关基因Pdx 1和Pax 4 （3）诱导刺激因子：Activin A ，bFGF，丁酸钠，Exendin-4 （4）与背胰细胞共移植,诱

9、导成心肌细胞 诱导方法： （1）类胚体培养 （2）单层贴壁诱导分化 2.诱导分化因素： （1）转录因子调控：Nkx2.5、GATA-4、Tbx5/20、Mef2c 、Myocardin 和HAND基因表达。 （2）细胞因子及调控：TGF-b、BMP、Wnt 家族蛋白、FGF等。 （3）化学诱导剂：RA，DMSO和垂体后叶素等。 （4）共培养诱导分化：与内脏内胚层细胞共培养。 （5)表观遗传修饰的调控:DNA 的去甲基化和组蛋白的乙酰化修饰促进分化。,分化心肌细胞的鉴定：,诱导成造血干细胞 （1）促进基因表达：Bcr/Abl；HoxB4；Cdx4；IL-3、IL-1和GM-CSF。 （2）基质细

10、胞共培养：骨髓基质细胞；肝基质细胞； （3）血细胞因子(SCF、G-CSF、Flt3- 配体、IL-3、IL-6 等)诱导。,诱导成生殖细胞 （1）体外分化 ESC精子 子代 ESC卵原细胞卵泡样结构囊胚 （2）体内分化（注入睾丸） 诱导条件：体外培养的微环境，加入TGF、整合素等。 已可分化为单倍体生精细胞，注入卵细胞后，可发育至囊胚。,五、人胚胎干细胞研究的意义 人胚胎发育机制及影响因素的研究 用于药物机理和毒性试验的研究，减少人体和动物的实验和临床研究。 将胚胎干细胞分化为功能细胞、组织和器官，用于移植治疗。 基因功能研究：基因敲除；基因修复；基因改造等。 基因治疗的载体。,1999年1

11、2月，美国科学杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。,六、ES细胞研究面临的问题 用于干细胞研究的胚胎来源困难 如何保持胚胎干细胞的全能性 干细胞在体外发育成完整的器官尚难以做到 分化细胞移植仍有可能发生免疫排斥 安全性问题 分化后的细胞是否有致瘤性？ ES细胞培养过程中易出现遗传变异 动物细胞携带的病毒感染人类 6. 法律和伦理问题,解决胚胎干细胞来源有限的途径： (1) 未成熟卵的体外成熟,（2）体细胞重编程(去分化) 重编程 成纤维细胞ES样细胞嵌合体 Oct4 Sox2 c-Myc Klf4,（Nature

12、 2007）,避免免疫排斥的方法 （1）建立足够量的带有不同组织相容性抗原 的胚胎干细胞系 （2）Knock-out 胚胎干细胞的组织相容性抗原 （3）治疗性克隆（受者的体细胞核移植）（4）体细胞重编程,治疗性克隆（therapeutic cloning ）： 去核卵细胞 + 受者体细胞核 克隆 囊胚 分离内细胞群 ES细胞建系ES细胞的诱导分化移植治疗,通过治疗性克隆获得的胚胎干细胞特点 具有与核提供者相同的遗传特征。 移植后可避免免疫排斥,人胚胎干细胞遗传变异问题 国际干细胞研究组织（International Stem Cell Initiative，ISCI）倡导下，来自中国、英国、美

13、国、等19 个国家对125株人胚胎干细胞进行遗传变异研究，发现： （1）ES细胞在体外长期培养过程中会出现许多共有的遗传突变、缺失和扩增。 （2）1 号、12 号、17 号以及20 号染色体最易产生变异。 （3）BCL2L1突变后过度表达，使细胞在培养中逐渐拥有生长优势。,七、诱导的多潜能干细胞（iPS细胞） 将若干种转录因子同时导入已分化的体细胞，使之成为类似ES细胞的多潜能干细胞，称为诱导的多潜能干细胞 ( induced pluripotent stem cells，iPS 细胞)。 成纤维细胞ES样细胞嵌合体 Oct4 Sox2 c-Myc Klf4,iPS细胞的研究进展： 2006年

14、获得小鼠的iPS细胞 2007年获得人的iPS细胞 2009年获得iPS细胞来源的小鼠 2009年将iPS细胞诱导成血小板 2008年被Nature杂志评为世界十大科学突破之首,iPS细胞的来源： 成纤维细胞、B 细胞、肝脏细胞、胃上皮细胞、胰岛细胞、角化细胞和脂肪干细胞等。 神经干细胞或前体细胞本身高表达Sox2，因而只需要O ct4和K lf4两种因子即可诱导为iPS细胞 。 目前使用较多的是皮肤成纤维细胞、B细胞、脂肪干细胞。,iPS细胞的诱导： （1）Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4。（2006年） Oct4：有维持ES细胞自我复制和促进ES细胞分化的双重作用。 Sox2：作为

15、Oct4的协作因子对ES细胞中的下游靶基因进行调控。 Klf4：可以维持Oct4 的表达， 并抑制ES 细胞的分化。 c-Myc：为原癌基因，具有维持细胞多能性的作用。 （2）Oct4、Sox2、Nanog 和Lin28。（2007年）,将iPS细胞注入四倍体补偿的囊胚，获得了iPS细胞来源的小鼠。 （Zhou Q， Nature，2009）,iPS细胞的全能性,iPS细胞的临床应用风险： 1.致瘤性： c-Myc为癌基因， Klf4也有一定的致癌性。20%的子代可发生肿瘤。 解决办法： （1）仅用Oct4、Sox2和Klf4，诱导效率低，但无成瘤性。 （2）改用小分子化合物BIX201294

16、( G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂)和B ayK8644( 一种钙激动剂) 、加上Oct4和K lf4。,2. 病毒感染导致的遗传性状改变 逆转录病毒或慢病毒载体感染细胞会将外源基因序列随机整合到基因组, 可能导致插入突变，且持续表达会抑制诱导分化。 解决办法： C re /LoxP重组系统被用来除去iPS细胞中的外源重编程因子以得到没有外源因子的iPS细胞。 采用PB转座子技术从基因组中剔除插入的外源基因。 应用基因产物进行诱导。,3. iPS 细胞的遗传安全性问题 （1）iPS 细胞比ES 细胞或产生iPS 细胞的体细 胞具有更多的遗传学和表观遗传学异常。 染色体异常 基因拷贝数变异 点突变

17、：每个iPS 细胞克隆中平均存在5个蛋白质编码序列的点突变。 表观遗传学变异：在CG 二核苷酸区的异常甲基化和在非CG 区的异常甲基化。 （2）在iPS 细胞产生的不同阶段都可发生遗传学异常 （3）iPS 细胞中出现的遗传损伤具有潜在的致癌性：易发生基因扩增、缺失或点突变的区域通常富含细胞周期调控基因和癌基因。,iPS细胞的应用前景： 1.替代治疗 2007年，Hanna J等，镰刀形红细胞贫血症成纤维母细胞iPS细胞去除cMyc基因正常基因型的iPS细胞定向分化成为造血前体细胞 移植红细胞形态由镰刀状恢复为圆盘状。 2010年，Takayama N 等，用hiPS细胞诱导产生了血小板，且证明

18、有抗凝作用。 2.提供体外的疾病模型 用于研究疾病形成的机制、筛选新药、以及开发新的治疗方法。 2008年，Park 等将10 种不同遗传病患者的细胞诱导为病人特异性的iPS 细胞系（腺苷脱氨酶缺乏性重度联合免疫缺陷症、进行性假肥大性肌营养不良、帕金森病、亨廷顿病等）。,iPS细胞研究的重要事件： 2006年，Takahashi 和Yamanaka将小鼠的成纤维细胞诱导为iPS 细胞（Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4 ） 2007 年， Thomson使人类新生儿成纤维细胞重构为iPS 细胞（Oct4、Sox2、Nanog 和Lin28） 2008 年，Schenke-Layland

19、 等将iPS 细胞分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。 2009 年，东京大学研究人员使iPS 细胞分化血小板。 2009年，Jaenisch 将移除人iPS 细胞中的外源基因，并将其诱导成多巴胺神经元。 2009年，周琪和高绍荣同时获得了完全由iPS 来源的成体小鼠。,我国科学家在iPS 研究领域中的贡献 2008 年，邓宏魁首次建立了恒河猴iPS 细胞系。 2009 年，肖磊首次建立了大鼠iPS 细胞系。 2009 年，肖磊首次建立了猪iPS 细胞系。 2009年，高绍荣建立了 型地中海贫血病人的iPS 细胞系 2009年，周琪和高绍荣同时获得了完全由iPS 来源的成体小鼠。 200

20、9年，邓宏魁将人iPS细胞诱导成成熟胰岛细胞和肝细胞。,八、诱导型功能细胞的研究进展 转分化：将一类体细胞直接转化为另一类体细胞，而不先重编程为多能性干细胞后再分化为有功能的体细胞。 诱导型功能细胞：通过特定转录因子的组合作用，可将终末分化细胞直接诱导成特定的功能细胞。,诱导型神经细胞 2010 年，Vierbuchen 等将Ascl1、Brn2 和Myt1l基因通过病毒介导的异位表达，可将小鼠成纤维细胞转化为诱导型神经细胞(iN 细胞)。 2011年，Qiang 等直接将阿尔茨海默病患者的成纤维细胞转分化为有功能的人类诱导型神经细胞(hiN 细胞)。 诱导型心肌细胞 将Gata4、Mef2c

21、 和Tbx5，通过异位表达可将成纤维细胞转分化成诱导型心肌细胞(iCMs)。 诱导型肝脏细胞 将Gata4、Hnf1 和Foxa3通过异位表达可将成纤维细胞转分化成诱导型类肝脏(iHep)细胞。,九、胚胎干细胞研究的法律和伦理问题 争论的焦点: 1.胚胎的生命权 2.父母的知情权 2.治疗性克隆和生殖性克隆 国际上多数国家的政府和学术界支持胚胎干细胞的研究，包括治疗性克隆的研究。,干细胞来源的伦理学问题 可被使用的细胞： （1）体外受精时多余的配子或囊胚； （2）自然或自愿选择流产的胎儿细胞； （3）体细胞核移植技术所获得的囊胚； （4）自愿捐献的生殖细胞。,不同国家、地区的人胚胎干细胞研究政

22、策 允许或制定灵活的ES研究政策： 澳大利亚，比利时，巴西，加拿大，中国，捷克斯洛伐克，丹麦，爱沙尼亚，芬兰，法国，希腊，匈牙利，冰岛，印度，以色利，日本，拉脱维亚，荷兰，新西兰，俄国，新加坡，斯洛文尼亚，南非，韩国，西班牙，瑞典，瑞士，中国台湾，泰国，英国。 严格限制： 德国，意大利，香港。 完全禁止： 奥地利，爱尔兰，立陶宛，挪威，波兰。,美国政策： 2001年美国总统宣布：允许政府经费资助人体胚胎干细胞研究，但仅限于已有的胚胎干细胞。 2005年美国国会众议院通过胚胎干细胞研究提案，但被布什否决。,中国政府政策： 2004年1月由科技部和卫生部共同制定了人胚胎干细胞研究伦理指导原则 。,人胚胎干细胞研究伦理指导原则 第一条为了使我国生物医学领域人胚胎干细胞研究符合生命伦理规范，保证国际公认的生命伦理准则和我国的相关规定得到尊重和遵守，促进人胚胎干细胞研究的健康发展，制定本指导原则。 第二条本指导原则所称的人胚胎干细胞包括人胚胎来源的干细胞、生殖细胞起源的干细胞和通过核移植所获得的干细胞。 第三条凡在中华人民共和国境内从事涉及人胚胎干细胞的研究活动，必须遵守本指导原则。 第四条禁止进行生殖性克隆人的任何研究。 第五条