血型基因分析.ppt

1、血型系统基因分型，DNA是遗传物质的基础，DNA萃取法，一个经典的酚萃取法，可得到100-200kb左右的染色体组片段原理：个别细胞球在蛋白酶k、SDS、RNA酶催化剂的作用下，胞质膜和核膜消化破裂，蛋白质变性成为肽或氨基酸RNA酶催化剂分解被污染的RNA。 饱和酚、三氯甲烷提取可使蛋白质和DNA脱离，在高盐存在下使乙醇沉淀DNA沉淀。 进行步骤，提取白细胞：(淋巴液分离法)将全血1.10ml放入10ml EDTA抗凝血管中，横摇2 .另取两条10ml离心管，分别加入3ml淋巴分离液3 .将全血沿管壁慢慢分别放入上述两条离心管，各5ml 4.水平5 .扔掉上清，吸取中层(白细胞层)，放入相同的

2、离心管中6 .流平、离心分离(Temp:20、Time:10min、RCF:2000G )； 7 .扔掉液体，加入35ml生理盐溶液，平整后离心5分钟8 .控制干燥，放入-20冰箱保存。 DNA产品纯度，A260/A280低于1.72.0之间，表明有蛋白质污染，可再次进行酚、三氯甲烷、异戊醇提取、二、酚萃取法，原理：需要全血或培养细胞球快速制备高纯度染色体组DNA全血300微升DNA的大小是100-200kb。 制备的DNA浓度一般在0.05-0.2微计程仪拉姆/微升之间。 可直接用于PCR、基因克隆、DNA测序等。 在一般步骤中，加入试剂1.2ml、edta抗凝血全血1.2ml，在室温下反复

3、搅拌56次，观察到红细胞球的全部开裂。 离心分离后留下沉淀添加剂b和c、d，破坏白胞质膜和核膜。 离心后去除上清液，用异丙醇使DNA丝沉淀。 用70%乙醇洗涤后，用TE溶解于56中。 三、盐析法、外周血0.5ml、EDTA抗凝血、血红细胞溶液1ml溶解血红细胞，离心丢弃上清，沉淀用无菌三蒸水洗耳恭洗涤后加入蛋白酶k、SDS等。 56、水浴10分钟，用饱和氯化纳金属钍使杂蛋白沉淀，以2.5倍体积将无水乙醇沉淀DNA预冷，最后DNA丝块溶于无菌三蒸水中，待4天保存。 四、用离心柱提取DNA，原理：用蛋白酶培养10分钟破坏胞质膜，离心时蛋白质和其他物质通过滤层，大分子的DNA和RNA滞留在滤层，最后

4、经TE溶解，得到染色体组DNA。 200微升的全血能产生3-12gDNA。 操作非常简单，很快。 缺点：在云同步中获得RNA。 可以加入RNA酶催化剂来解决问题。 聚合酶链式反应聚合反应PCR、聚合酶链式反应概念、PCR技术：通用、体外快速扩增目标DNA片段的技术。 几小时，特异性扩增目的DNA 100万倍：皮克斯(pg )麦克计程仪拉姆(g )，这样分析DNA片段的结构和功能非常方便。 PCR技术的发现，1971年Khorana等人阐述了PCR的雏形。 1983年美国Mullis等人发明了PCR方法。 1985年美国Cetus公司开发了一种有应用价值的PCR技术，Kary B Mullis，

5、(1944-)，1985年提出了PCR方法1993年度诺贝尔化学奖，一方面提出了PCR基本原理，PCR是一种DNA体外合成技术，类似于体内的DNA复制过程。 根据DNA半保留复制的反应历程。 PCR合成DNA的过程比细胞球内复制简单得多。 在细胞球内复制的过程中，(1)在细胞球内相关蛋白的参与下，DNA双线解链为2条单链，各自为铸造模型。 2 )引物酶催化剂等以2条单链为铸造模型分别合成一段引物，引物提供3oh末端。 3)DNA多聚酶以亲DNA单链为铸造模型，以dNTP为原料，遵循碱基对原则，从引物的3端沿53个方向逐个连接核苷酸，最终形成新的DNA双链。 PCR过程、Denaturing 9

6、5C过程、Annealing Tm-5C过程、Extension 72C过程、PCR过程：1.高温变性过程、PCR过程：2.低温退火。 实际上，放大效应低于指数增加，为(1 X)n。 一般进行30个循环左右，特定区域的DNA量至少增加106倍。PCR产物的积累规律、PCR反应初期，目的DNA片段的增加呈指数增加。 随着目标DNA扩增产物的积累，酶催化剂的催化反应趋于饱和，此时DNA扩增产物的扩增变慢，即出现“平台效应”。 到达平台所需的周期数通常在30次以下。 PCR校正、聚合酶链式反应中的改性、退火、拉伸温度和时间以及循环次数由具有可编程快速升温和快速降温装置的PCR校正控制。 标准PCR实

7、验室的组成、准备室基因提取室扩增室产物分析室的单向式物流、二、PCR技术的特点、高度敏感性：极微量(pg)DNA可扩增到紫外光可见水平(ug )是最主要的特征，它对单拷贝基因为2 .高度专一性： PCR扩增的专一性为2 另外也受到退火温度的影响。 3 .适用样品的广泛性：对样品的要求不太严格：1)DNA、RNA 2)可以精制也可以粗制3 )可以是新鲜的组织也可以是旧的组织4 )可以是细胞球，体液4 .操作可以简便快捷，第二节参与PCR反应体系的因素及其作用， 铸造模型DNA引物Taq DNA多聚酶dNTP Mg2，参与因素有：缓冲液反应温度循环次数PCR修订、病原体标本：细小病毒、细菌、真菌、

8、螺旋体、立克次体、支原体等。 病理大姨妈标本：有细胞球、血液、绒毛、羊水细胞球、尿液、上皮细胞球、体外培养细胞系。 法医学标本：有血斑、精斑、毛发等。 根据考古标本(含核酸的物质)、常见扩增对象(含核酸的标本):待扩增DNA片段的两端序列化学基合成两条人造的，并建立可与铸造模型DNA互补物结合的脱氧寡聚核苷酸。 3末端引物：与(编码链)十大板块的3末端序列互补。 专一性：由于引物只与DNA的一个特定序列互补地结合，两个引物与DNA数字大板块特异性结合决定扩增的DNA区。 长度： 2条引物分别与欲扩增的DNA片段的两端互补，DNA片段的扩增仅限于引物间的部位。 引物的基本要求是：1)引物的长度适

9、当，一般为1630个核苷酸。 416=4.29109人类基因组3109 bp，引物太短：影响PCR专一性的引物太长：需要提高相应的退火和拉伸温度，超过Taq DNA酶催化剂的最适温度(74 )则影响PCR的专一性。 2)G C含量一般占4555，有利于引物与铸造模型的结合。 3)4种盐化学基随机分布，使相同的盐化学基序列不连续出现3个以上，否则引物和数字大板块容易错配。 4 )不能在引物自身上存在互补序列，以免形成发卡结构。 5 )为了避免引物二聚体的形成，两个引物之间不能存在互补序列。 6 )引物与非特异性序列的同源性不能超过70%，或不能有连续8盐化学基互补性。 不那样做会导致非特异性的扩

10、张。 7 )引物3末端盐化学基必须与铸造模型正确情侣对戒(引物3末端最佳盐化学基选择是g和C) 8)引物的5末端可以修饰，如导入酶催化剂位点、突然变异位点等标识牌萤光素、生物素等，引物的使用要求远远高于模板浓度，一般为0.10 Taq DNA多聚酶从1969年Brock在美国黄石国家公园的温泉(近100处)培育的水栖嗜热菌株中首次分离纯化出耐热的Taq DNA多聚酶。Taq DNA多聚酶的使用要求，1)Taq酶催化剂的浓度通常为12.5 U/100l，过多则浪费，容易导致非特异性放大。 2 )适当的拉伸温度(即DNA合成时的温度)一般为Taq酶催化剂的最适温度7075。 反应温度，1 .改性温

11、度和时间： 95，30”单链DNA为单链。 2 .回复温度和时间： 55，30”1引物与铸造模型互补结合。 回复性温度对专一性有很大影响。3 .拉伸温度和时间： 7275，12taq使dNTP催化，从引物的3oh端与铸造模型互补地合成新的DNA链。 反应条件，脱氧核苷三磷酸(dntp ) :合成DNA的原料。 浓度是20200摩尔/升。 mg2:taq酶催化剂的必需活化剂。 浓度为0.52.5mmol/L。 太少：酶活力显着下降过多：引起非特异性扩增。 反应缓冲液：常用10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.38.8是Taq酶催化剂的最佳pH值。 周期数：主要依赖于数字大板块DNA的

12、开始浓度，适当的周期数为25 30次。 循环数过少：生成物量过少循环数过多：非特异性扩增、PCR循环、94C、5 min (完全改性铸造模型DNA ) 3540循环改性： 94C、30秒退火50-60C、30秒延迟72C、45秒假阳性：微量DNA污染泰一次性物品器材、一次性手套、注意事项、假阴性： Taq酶活力、抽样误差、试剂保管、有效期、阴性阳性对照区分引物2的乐队特异性乐队和非特异性条带，分子生物学技术用于ABO血型分类。 ABO、Lewis、h、I、Globoside和p基因查询密码糖基转移酶，这些个糖基转移酶催化合成糖脂和糖蛋白上的低聚粗多糖。 其他基因查询密码在血红细胞表面表达的蛋白

13、抗原。 血型系统的基因基本上是染色体局部化和爱沙尼亚克朗测序分析a bo9 q 34.2 landsteinerwiner 19 p 13.2 MnS4q 2831 chido/Rodgers6p 21.3 p 22 q 13.2 hh 19 q 13.3 r h1p 36.1-34kxxp 21.1鲁特朗19 q 12-13ger bich2q 14-21kell7q 33cromer1q 32雷wis 19 p 13.3 knops Ian 11 p 13 k 7q 12-21 rap h 11 p 15.5 yt7q 22.3-23 xgxp 22.32 I6p 24.2 sci Ann

14、a1p 36.2-22.1 glob ba 13.313.2 gi l9p 13.3 colton7p 14 rhassociatedglyco 1990年克隆复制第9号染色体的A1糖基转移酶基因长为1062bp，7个外显子、查询密码蛋白质的分子量为411的ABO血型系统抗原结构及其合成a基因查询密码a转换酶、b基因查询密码b转移酶、a、b酶分别可以催化糖基化反应， 分别将-N-乙酰半乳糖和-D-半乳糖连接到h前驱物上，形成a、b抗原决定克拉星空卫视。 o基因不查询密码活性酶催化剂。 ABO血型系统抗原结构及其合成(1，2 ) fucosyltransferasegpd-fucose El-f

15、ucose-n-acetylgalactosaminyltransferasegalnac (n-acetyl-d-d ABO血型系统基因在染色体上您可以选择、或者、或者、或者、或者、或者、或者、或者、或者、或者、或者、或者、或者、或者、或者、或者、或者、或者、或者、或者、或者、或者、或者、或者-10k -900 -1700 -1500 454 1059bp、9q34.3、242 374 375 1065、扩展6扩展7， mostauthorsfocusontheireffortontheidentificationofdifferenceinthecodingsequenceofthelasttwocodingexons.althoughtheremaybemaybemayb idethisexons、91 % ofthesolubleformofa1transferaseiscontainedinthesetwoexons、suggestingtheimportanceofthelastwoexonfortransfe ABO血型系统cDNA序列(A1 )，第6外显子atggccgaggttgcggacgctgcgggaatgccacgcaatgcctcgaccta