《蛋白质的分析》PPT课件.ppt

1、蛋白质印迹，蛋白质分析，实验目的，了解蛋白质印迹的原理和意义，掌握蛋白质印迹的操作方法。蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到尼龙膜上，进行蛋白质印迹分析和鉴定。实验原理：蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶中的蛋白质条带被转移并固定在载体(如尼龙膜、硝酸纤维素膜和聚偏氟乙烯膜)上，膜上的蛋白质或多肽作为抗原与相应的第一抗体和酶标第二抗体反应。在用合适的溶液冲洗以除去未结合的抗体后，将它们在含有底物的溶液中培养以显示条带，然后可以检测样品。电迁移1。对蛋白质样品进行SDS-PAGE，溴酚蓝用完凝胶后停止电泳。2.切割24张定性滤纸和一张与凝胶大小相同的聚偏氟乙烯膜。在膜的一个(左)角做一个标记

2、(或切角)，依次在100毫升甲醇和去离子水中浸泡10秒钟和5分钟，然后用滤纸和海绵(纤维)垫将其浸泡在转移缓冲液中。3.剥下胶水，把凝胶切成合适的大小，切角做标记。“夹心蛋糕”制作(1)，4。顺序：负电极(黑色孔板)纤维垫-12滤纸-凝胶-聚偏氟乙烯膜-1-2滤纸-纤维垫-正电极板(白色孔板)扣入膜转移罐。夹心饼制作(2)、电迁移，根据以上示意图，连接电源(凝胶侧与负电极相连，聚偏氟乙烯膜侧与正电极相连)，用恒流电泳2小时，电流为：膜面积(cm2)x2mA。关闭电源，取出膜，放入塑料盒中，用雨披S染色约5分钟，回收雨披S，然后用蒸馏水洗掉背景染料显色，在室温下干燥后观察蛋白带的位置，然后用TB

3、ST浸泡几次，完全洗掉雨披S染料。6.将膜放入塑料盒中，加入20毫升密封溶液，在脱色摇床中缓慢摇动，并在室温下密封过夜1小时或4小时(色谱冷冻器)。三种目标蛋白与第一种抗体结合。7.丢弃封闭溶液，用TTBS稀释试剂B (1: 1000)，加入510毫升到盒子中，在室温下轻轻摇动培养1小时。然后试着回收抗体溶液，并将其储存在-20下重复使用。在室温下用TBST洗涤膜3次，每次10分钟和15分钟。杂交和显色。用TBST稀释试剂C (1: 1000)，混合均匀，加入到盒子中，每个膜约510毫升，室温下振荡1小时；9.尝试回收二级抗体并将其储存在20C用TBST水洗膜4次，每次1015分钟。用三丁基锡

4、化合物清洗薄膜15分钟。配制DAB微量溶液，将膜投入显色，并随时观察带的外观；蒸馏水洗涤膜；擦干胶卷并拍照。将薄膜放在密封的塑料袋中。试剂1。转移缓冲液：2.9克甘氨酸(39毫摩尔/升)，5.8克Tris碱(48摩尔/升)，0.37克SDS(0.037%)，200毫升甲醇(20%)，定容至1000毫升；每组剂量约为500毫升。2.密封溶液：5%脱脂奶粉和0.02%叠氮化钠，溶于TBST溶液；(大众阻断解决方案)3。胭脂红染料溶液：将0.5克胭脂红溶于1毫升冰醋酸中，加水至100毫升；4.TBST膜清洗液：三丁基锡化合物缓冲液含1%吐温-20；高压灭菌并在室温下储存。试剂5DAB，由试剂盒提供，使用前用100毫升三盐酸(pH7.5)配制成5毫克/毫升。反应溶液配方(5ml): 100mm tris-HCl，ph 7.5 2.5ml 5mg/ml dab 0.5ml 30% H2O 2 2.5 ul ddh 20 2ml 6tb 3360 100mm tris-HCl，0.9% (w/v) NaCl，ph 7.