20RNA生物合成及加工s(1).ppt

1、1,Monk Transcribing Manuscript,- DNA转录合成RNA - RNA加工 - RNA复制,LW-1,以DNA分子的一条链为模板、在DNA指导的RNA聚合酶催化下进行的RNA合成,以RNA为模板进行的RNA合成(主要为某些病毒基因组的复制),RNA生物合成及加工,DNA转录,RNA复制,2,同为酶促核苷酸聚合反应，DNA转录和复制的基本化学性质相似： - 均以DNA为模板 - 聚合过程都是在(脱氧)核苷酸之间生成磷酸二酯键 并连接成多聚(脱氧)核苷酸新链 - 合成方向均为53 - 都遵从碱基配对规律 但相似之中又有区别： 复 制 转 录 模板 两股链(全长) 模板链

2、(不对称/选择性) 原料dNTP NTP 酶 DNA-pol (需要引物) RNA-pol (无需引物) 产物 子代双链DNA mRNA, tRNA, rRNA, 配对 A-T, G-C A-U, T-A, G-C,LW-2,1. DNA转录合成RNA,3,26-2,26-3,- 结构基因分布在两股链的不同区段， 而且只有其模板链才能被转录 - 通常都假定控制转录的调节序列是位于编码链上的, 转录模板不对称 (不对称转录) - 与需要保留物种全部遗传信息的DNA复制不同，转录 是有选择性的：要根据细胞类型及其在不同发育阶段 的需求和生存条件的变化而选择性进行,模板链(Watson),编码链(C

3、rick),转录产物,4,26-4 (3rd),H21.2,- 亚基有多种类型，分别 辨识不同的调节序列，最 常见的是70 - RNA合成的活性部位由 和构成 - 细胞内 : : : = 4,000 : 2,000 : 2,000 : 600 - 缺乏独立的35校对外切 活性位点，但有些在错配时 可直接逆转聚合活性校正之,全酶为五亚基的六聚体2 - 活细胞的转录起始需要全酶， 为辨认转录起始点所必需 - 转录延长阶段/试管内合成仅 需要核心酶2, 转录酶/RNA聚合酶,core enzyme (Mr 390k),holoenzyme,(cf. p456：亚基功能),原核类(E. coli)的R

4、NA-pol (催化多种RNA合成),自学,5,Zh12-4,RNA-pol、各亚基电泳分离,转录产物鹅膏蕈碱 RNA-pol 45S-rRNA 耐受 RNA-pol hnRNA 极敏感 RNA-pol 5S-rRNA 中度敏感 tRNA snRNA,- RNA-pol最为活跃：mRNA是 DNA和蛋白质之间的衔接点， 寿命最短且最不稳定，需要经常 重新合成 - 真核类RNA-pol均无原核类亚 基的对应物，需借助各种转录 因子才能辨识及结合于启动子,真核类RNA-pol主要有三种，均由多个亚基所组成,自学,6,操纵子转录功能单位(顺式作用元件) = N 个结构基因上游调控系列(包括启动子)

5、启动子RNA-pol全酶结合模板处(由亚基辨识) 可采用RNA-pol保护法(DNA足迹法)定位 启动子共有序列 35序列：TTGACA识别区 10序列：TATAAT= Pribnow box 启动转录的DNA局部解链处 由平衡常数测定结果推论：35序列为亚基对转录起始 的辨认位点，与之松散结合后全酶即向下游移动， 到达Pribnow box即跨入转录起始点，形成相对 稳定的RNA-pol+DNA复合物并开始转录,LW-3,operon,promoter, 模板与酶的辨认结合,7,Zh12-5, 启动子中的-35和-10共有序列,识别区,启动转录的DNA解链处,真核类也有类似的起始区上游序列，

6、多为5-TATA (Hogness box)，但不如原核类的-35和-10序列典型,1,不对称的启动子 结构决定转录方向,突变会影响RNA-pol与启动子结合的速度，但不影响附近的DNA解链,突变的影响与识别区的相反,自学,8,26-1a,- DNA模板在转录过程中 始终有17 bp被暂时 解开并形成转录泡 - 转录得到的RNA-DNA 杂合链始终保持8 bp - RNA-pol在延长阶段大约 覆盖35 bp的DNA区段,- 原核类在起始阶段需要全酶参与 - 延长是核心酶催化下的NTP聚合反应 - 转录终止一般具有两种方式,转录泡, 转录过程 (E. coli) 分为起始、延长和终止三阶段，全

7、程都需要RNA-pol催化 (真核类的转录与之基本相似 但更为复杂),NTP channel,9,26-1b/c,- 转录泡前、后分别形成正、负超螺旋 - 需要相应的拓扑酶参与解决因此而产生 的拓扑性变化, DNA在转录过程中的超螺旋变化,重旋,解旋, subunit,自学,10,26-6,a. 结合 - RNA-pol先与启动子相互作用以 形成封闭的复合体 - 随后在-10序列和+23位点之间 的1215 bp区段解开双螺旋并 形成开放的复合体 b. 启动 (转录的引发启动子的解离) - 一旦RNA最初的89 nt片段发生 聚合，亚基便随即释出 - 随后RNA-pol核心酶也离开启动子 并开

8、始延长RNA链,(其双链尚未解开), 转录起始可分为结合 和启动两阶段,11,LW-4,- 起始复合物：RNA-pol (2)DNApppG(pN)89-OH3 - RNA-pol可催化两个与模板配对的NTP生成磷酸二酯键直接 连接而无需引物 - 起始生成的RNA(5端) 1st个核苷酸总是GTP/ATP，与2nd个 NTP聚合后仍保留其5端的ppp，即产物为5pppG/ApN-OH3 (hnRNA加工时即在该独特的四磷酸二核苷酸结构上加帽) - 的脱落导致核心酶构象变化，以适应与模板不同区段结合的需要 - 转录复合物：RNA-pol (2)DNA(pN)n-OH3 - 核酸中碱基配对的稳定性

9、为GC AT AU，因而已转录完毕 的局部DNA双链必然会趋于重旋复合，而转录产物RNA的5端则 逐渐伸出转录泡外, 转录起始, 转录延长,12,LW-5,依据是否需要有特殊蛋白因子的参与可分为两类： 内在性终止RNA-pol对DNA模板的终止信号(内在性终止子) 直接应答而停止转录 - 特殊回文区段富含GC序列，具有链内碱基互补配对能力， 可使转录的RNA形成1520 bp的茎-环/发夹结构 - 回文区段后的富含AT序列使转录的RNA 3端生成poly U(68) 依赖因子性终止停止转录需要有因子参与 - 因子为六聚体蛋白，具有RNA-DNA解螺旋酶活性 - 因子能结合RNA并通过水解NTP

10、在RNA链上前移 - 与RNA-pol结合后将导致因子和酶都发生相应的构象 变化，进而在其解螺旋酶活性作用下使RNA-DNA杂化 双链拆离并释出转录产物, 转录终止,遇到某些特殊区段时，RNA-pol会在DNA模板上停顿而不再前移并导致转录产物RNA脱落,13,G31.7,26-7b,poly U(68),转录产物的3端可通过链内碱基对形成发夹结构而改变RNA-pol的构象，进而影响酶和模板的结合方式，使酶不再向下游移动而停止转录 - RNA链在终止区要形成自身双链，DNA 则倾向于恢复双链结构，因而转录产物中 形成的杂化链要比应有的长度更短，杂化 链更不稳定而导致转录复合物趋于解体 - rU

11、dA配对最不稳定，故3端的poly U可 促进RNA链从模板上脱落, 转录内在性终止 (E. coli的trp基因),14,G31.8, 依赖因子性终止,终止子,因子识别并与mRNA结合,利用水解NTP提供的能量前移,RNA-pol遇到由终止子转录的RNA区段时暂停/减缓转录,因子赶上并与之结合，导致自身和酶都发生相应的构象变化,解螺旋酶活性使杂化双链拆离而释出转录产物,15,D8-28, E. coli转录过程小结,与核心酶结合并辨认模板转录起始位点,转录开始,RNA链延长,与RNA 聚合酶结合,RNA、 及酶的释放,释放及循环,自学,16,26-10,平面环的嵌入使DNA双链变形 - 双螺

12、旋解旋23 - 相邻碱基对分开7,放线菌素D和吖啶的平面环均可通过嵌入DNA双螺旋的相邻GC碱基对之间而阻断转录的进行, 转录抑制剂,两个五环肽能与DNA双螺旋的浅沟结合而干扰转录的启动,自学,17,G31.4,利福霉素B和利福平均能专一性抑制原核生物的RNA-pol,利福霉素B - 专一性结合RNA-pol 的亚基、阻断启动 部位与1st NTP的结合 - 合成一旦启动就不再 能影响转录的延长 利福平 - 允许1st个磷酸二酯键 的形成，但阻断 RNA-pol沿DNA模板 前移,自学,18,LW-6,- 转录后生成的大多是RNA前体(初级转录产物)，需要 在酶的作用下经过一定的加工后才能成为

13、有活性的 成熟RNA - 真核类的转录后加工主要发生在细胞核内，各种RNA 的加工过程均具有相应的特点 剪切和剪接前者仅为剪去部分序列，后者在剪切后 还需要将相应的片段再连接起来 末端添加核苷酸eg. 5-端加帽和3-端加尾 化学修饰主要发生在碱基上，eg. 甲基化、还原和 脱氨等反应生成tRNA中的某些稀有碱基,2. RNA加工,19,26-11,- 加工方式包括剪切、聚腺苷酸化和剪接(去除内含子并连接外显子) - 5-帽多在前体转录完成之前加上，3-poly A尾则在加工过程中形成,转录及5-加帽(m7G),形成初级转录产物 (= hnRNA),剪切、聚腺苷酸化和剪接等加工处理,外显子 D

14、NA中的编码序列，可转录为RNA并进而翻译成蛋白质 内含子 DNA中的间插序列，转录成RNA后即被切除而不翻译,poly A(80250), 真核类的mRNA前体及其加工成熟,20,26-12 (3rd),先将该基因的DNA片段完全失活，再加入相应的成熟mRNA进行复活处理，在RNA-DNA杂化链上呈环状突起(无法与相应的RNA碱基配对)的DNA区段即为内含子,whole gene for ovalbumin, 杂化法检测基因内含子 (鸡卵清蛋白),21,26-13,- 游离鸟苷(酸)的 3-OH对外显子和 内含子之间的磷酸 二酯键亲核攻击 - 新形成的磷酸二酯 键维持反应的能量 平衡(非水解

15、反应),由不同的内含子基本类型可派生出多种剪接方式 (cf. p606),自我剪接类型的1st步转酯反应,类型和均为自我剪接，分别借助于外源性的鸟苷(酸)和内源性的腺苷酸进行转酯反应，催化机制类似于拓扑异构酶, 剪接去除内含子,22,26-14,- 1st个亲核体可以是鸟苷、 GMP、GDP或GTP - 鸟苷(酸)3-OH亲核攻击5- 端剪接点，释出上游外显子 - 上游外显子的新游离3-OH 转而亲核攻击3-端剪接点 并以磷酸二酯键与下游外 显子的5-端连接 - 鸟苷(酸)仅为外源性辅助因 子，并未掺入外显子中 - 切掉的内含子可以再经由 类似的转酯反应而环化或 最终被降解,5-端 剪接点,3

16、-端 剪接点,攻击自身5-端15 nt处而环化, 类型自我剪接 (真核类细胞器基因),23,26-15,- 亲核体为内含子自身的某个 特定腺苷酸，由其2-OH对 5-端剪接点进行攻击，形成 不常见的2,5-磷酸二酯键并 构成套索结构，其余反应与 类型相似 - Thomas Cesh等(1982)由此 意识到，某些RNA也能具有 一定的酶活性，并进而提出 在生化及分子生物学中具有 里程碑意义的核酶概念,套索分支点处的腺苷酸 具有3个磷酸二酯键, 类型自我剪接 (某些真菌线粒体和 植物叶绿体基因),24,hnRNA剪接中U1和U2的作用,26-16a,为真核类mRNA剪接加工的主要方式， 反应机制

17、与类型自我剪接相似： - 内含子先形成套索结构 - 再经由转酯反应将两端外显子连接起来 - 反应需要有snRNP与内含子结合形成 的剪接体参与,核内小核糖核蛋白 由snRNA (核内小RNA)和相关蛋白组成，各种真核类的snRNP组分均高度保守, hnRNA剪接需要借助于snRNP剪接体,U1的5-端具有与内含子5-端互补的序列，两者的配对有助于确定内含子5-端剪接点,U2的互补序列可覆盖内含子中靠近3-端剪接点的特定腺苷酸残基并使之激活，后者在剪接时成为亲核攻击体 ( 辨识及结合3-端剪接点),假尿嘧啶,亲核攻击,自学,25,- U1和U2 snRNPs与hnRNA的5- 及3-端剪接点结合

18、(ATP供能) - U4/U6复合物和U5再与之结合 形成非活性剪接体(ATP供能) - 经内部重排转化为活性剪接体： U1和U4脱离，U6则同时与5- 端剪接点和U2互补结合，使 特定腺苷酸残基的亲核攻击体 靠近剪接部位(ATP供能) - 通过类似于类型的方式完成 剪接反应,26-16b, 剪接体的组装及剪接加工 (cf. p482),自学,26,26-17 (3rd),- 核酸内切酶断裂内含子的两端将其 移除，切口的5-端均为-OH，而 3-端均为2,3-环磷酸基 - 上游外显子3-端的2,3-环磷酸基被 环核苷酸磷酸二酯酶打开，形成2- 磷酸基和3-OH (亲核攻击体) - 下游外显子5

19、-OH经由激酶和连接酶 连续反应活化(消耗3 ATP当量) - 上游外显子的3-OH对下游外显子的 5-端攻击并取代其AMP，将两个外 显子以3,5-磷酸二酯键连接起来， 随后2-磷酸基被磷酸酯酶水解移除,AMP, 酵母和植物的tRNA前体剪接 需要ATP和核酸内切酶等参与 (反应机制类似于DNA连接酶),自学,27,26-12a,- 几乎所有真核类的mRNA在其5-端 都有一个以稀有的5,5-三磷酸连接 的7-甲基鸟苷 - 1st (起始鸟苷)和2nd个核苷酸的2-OH 有时也被甲基化(酵母缺乏) - 由RNA-pol/转录的其他类型RNA (非hnRNA)都没有这类5-帽结构,通常为G/A

20、,四磷酸二核苷酸, 首、尾修饰/末端添加,- 通常在hnRNA阶段已经存在有修饰 好的首、尾结构，先于mRNA中段 的剪接加工 - 首、尾修饰功能涉及到翻译的识别、 mRNA的稳定以及保护其模板活性, 5-端形成7-甲基鸟苷三磷酸帽,(m7G),28,26-12b,- 磷酸水解酶除去起始鸟苷的P - 鸟苷酰转移酶将GTP的GMP- 基转移给起始鸟苷的二磷酸基 生成三磷酸双鸟苷5GpppG- - 鸟嘌呤-7-甲基转移酶使新添加 的鸟苷N7位甲基化(帽0) - 2-O-甲基转移酶使原起始鸟苷 的2-OH甲基化(帽1) - 甲基供体均为S-腺苷Met, 5-帽的形成,转移GMP后再进行两步连续的甲基

21、化反应,自学,29,26-17,- hnRNA 3-端含有高度保守的腺苷酸 化信号序列AAUAAA - 酶复合体辨识并与信号序列结合，该 复合体包括内切酶、聚腺苷酸聚合酶 和几种多亚基蛋白因子，功能涉及到 辨识信号序列、引发断裂以及poly A 长度的调节等 - 内切酶在信号序列下游1030 nt部位 切断 - 聚腺苷酸聚合酶在切点处添加80250 A (反应无需模板，但需要具有游离 3-OH的RNA片段为引物) - poly A对翻译模板的稳定非常重要： mRNA的降解通常起始于poly A的 缩短(35降解)，而其去腺苷酸化 达到一定程度时还能引发5-端的脱帽 反应，进而导致mRNA的53

22、降解, 3-端添加多聚腺苷酸尾,30,26-18, 典型真核类mRNA加工小结 (鸡卵清蛋白基因),加工完成后只有 hnRNA前体转化为成熟的mRNA，后者进入胞液后再开始翻译,先导序列,31,26-23,酵母tRNATyr的加工,甲基化 eg. A/GmA/mG 还原 eg. U二氢U 核苷内转位 eg. 尿苷假尿苷 脱氨 eg. 腺苷次黄苷/肌苷, 化学修饰,多见于tRNA的前体加工，被修饰碱基的功能涉及到在翻译过程中tRNA对密码的识别,原核生物没有这类内含子,32,26-24, tRNA的常见修饰碱基,4-硫尿苷,次黄苷/肌苷,1-甲基鸟苷,假尿苷,N6-异戊酰腺苷,胸腺嘧啶核糖核苷,

23、二氢尿苷,自学,33,26-21, 原核类 - 30S前体断裂前先在 特定核苷酸处甲基化 (多为核糖的2-OH) - 在专一性核酸内切酶 作用下断裂成rRNA 和tRNA前体 - 经各种专一性核酸酶 作用最终产生16S rRNA，tRNA，23S 和5S rRNA - 有些种类在16S和23S rRNA之间以及前核糖 体RNA的3-端还含有 另外的tRNA片段, rRNA前体加工,由前核糖体RNA加工而得： 原核类30S RNA16StRNA23S5S rRNA 真核类45S RNA18S5.8S28S rRNA,1-RNase；2-RNase P (核酶)；3-RNase E,自学,34,2

24、6-22, 真核类,- 45S前体先在100多个 核苷酸残基上甲基化 - 经由一系列酶促剪接 反应最终生成18S, 5.8S和28S rRNA，反 应需要有各种核仁小 RNA (snoRNA)参与 - 真核类的5S rRNA大 多是通过RNA-pol 转录生成的,自学,35,LW-7, 与RNA病毒有关的基本概念 复制酶RNA指导的RNA聚合酶，具有高度模板特异性，只能 识别特定病毒自身的RNA (+)RNA具有(复制酶)mRNA翻译模板功能的病毒RNA ()RNA只有其互补链才具有mRNA翻译模板功能的病毒RNA,3. RNA复制,除了在遗传信息表达(翻译)和调节中具有决定作用外，RNA在有

25、些生物种类还是遗传信息的基本携带者，并能通过复制进行传递,()双链RNA (&复制酶 ),(+)RNA ()RNA ,mRNA (+)链, ()双链DNA ()DNA (+)RNA,()RNA (&复制酶), 病毒RNA复制的四种方式 (cf. 王镜岩等：p493),eg. corona virus,oncorna virus,复制酶,36,- (+)RNA类，基因组2731 kb - 通过胞吞作用和融合反应 进入宿主细胞并释出 (+)RNA - 正链5-端约20 kb序列翻译 产生复制酶/病毒RNA聚合酶 - 复制酶以正链为模板 合成完整的()RNA - 以负链为模板合成新的正链 以及一些长度不等的mRNA 嵌套片段(翻译各种病毒蛋白) - 新合成的正链与病毒蛋白在 Golgi体组装成病毒颗粒并释出,Golgi体,粗面 内质网,LW-8, SARS冠状病毒的复制,37,LW-9,小结：RNA生物合成及加工,- 转录由DNA指导的RNA聚合酶催化进行；依据双链 DNA的模板链以NTP为原料合成出RNA互补链；转录 可分为几个阶段：RNA聚合酶与DNA上的启动子序列 结合、转录合成的启动、延长和终止,-