第五章 植物的胚胎培养及离体.ppt

1、31 第五章 植物的胚胎培养及离体授粉,Hanning (1904) 最早在无菌条件下进行十字花科辣根菜、萝卜成熟胚培养获得成功。 Laibach (1925，1929)用宿根亚麻奥地利亚麻（Linum perenne L.austriacum）胚培养，得到了杂种植物。因为在远缘杂交的组合中，植物所结的种子发育不良，不能萌发。可将胚置于人工培养基上培养成功。 在高等植物种间或属间远缘杂交时的问题: 由于不亲和性，常常还会发生花粉不能在异种植物柱头上萌发或花粉管生长受到抑制不能进入子房的受精前障碍。 或即使受精，由于胚乳发育不良或因胚与胚乳间不亲和而使胚在早期败育。胚胎培养可以在胚乳发育不良时，

2、把胚在早期及时取出培养，有可能获得杂交的成功。,第一节 植物胚胎培养的类型和应用,植物胚胎培养（Embryo culture）是指胚和胚器官（子房、胚珠）在离体条件下培养发育成完整植株的技术。 一、胚培养类型 两类:幼胚与成熟胚培养 成熟胚一般在比较简单的培养基上就能萌发生长，成熟 胚生长依赖胚乳、子叶的贮藏营养，培养基要求简单。只要 提供合适的生长条件以及打破休眠，即可萌发成幼苗。 成熟胚培养技术要求不严格，将受精后的果实或种子（带 种皮），表面消毒后，剥取种胚,接种于培养基上，即可发 育成为一个完整的植物体。,幼胚指尚未成熟（发育早期）的胚。在离体培养时比成熟胚培养困难，要求的技术和条件较

3、高。 幼胚离体培养有两种不同的生长方式： 1)继续进行正常的胚胎发育，维持胚性生长。 2)迅速萌发为幼苗，不维持胚性生长，这种情况称为“早熟萌发”（precocious germination）。早熟萌发形成的幼苗往往畸形瘦弱，甚至引起死亡。,二 、培养方法,1、材料的选择与灭菌 取回大田或温室里种植的杂交植物的子房，用70%的酒精进行几秒钟表面消毒，再用0.1% HgCl2灭菌1030min，无菌水冲洗，即可用于外植体的分离和培养。,2、幼胚的分离及培养,幼胚的剥离 幼胚的培养 胚胎发育过程分为两个时期： 1）异养期（heterotrophy period），即在胚发育早期，幼胚由胚乳及周围

4、的组织提供养分。 2）自养期(autotrophy period) ，胚在代谢上已经能在基本的无机盐和蔗糖的合成培养基上生长，在营养上已相当独立。,Monnier(1976,1978)介绍了一种培养方法,胚乳看护培养 Ziebur等 (1951)报道，在进行大麦未成熟胚离体培养 时，培养基上存在来自同一物种另一种子的离体胚乳，对胚 的生长有明显的促进作用。 谷类胚胎嫁接的研究发现，当大麦胚移植到小麦的胚乳上 时，比在大麦胚乳上生长更好。 Kruse(1974)在某些属间杂交中，若把杂交未成熟的胚放 在事先培养的大麦胚乳上培养，能显著提高获得杂种植株的 频率。 大麦（Hordeum vulgar

5、e）黑麦(Secale cereale)属间杂交，采用这种方法有30%40%的杂种未成熟胚可以发育成苗，而用传统的胚培养法只有1%能成功。,De lautour等（1980）改良胚乳看护培养（图4-2）。他们把杂种离体幼胚嵌入到由双亲之一胚乳中，然后把二者一起放在人工培养基上培养。,三、胚胎培养的应用,1克服远缘杂交不亲和性 在远缘杂交中，由于双亲遗传和生理的不亲和性，产生受精障碍或胚乳不能正常发育，导致杂种发育不良或早期夭折。利用胚胎培养或分离早期幼胚培养，在试管中培养成再生植株，可防止远缘杂交中优良种质的丢失。 2打破种子休眠 一些种子发育不完全或有抑制物存在而影响种胚发芽。利用含有糖和无

6、机盐的培养基进行胚培养，可使这些植物的幼胚达到生理和形态上的成熟而萌发成植株。 3缩短育种周期 常规育种和胚培养技术相结合，可缩短育种时间。 4克服种子的自然不育性 长期营养繁殖的植物，虽然具有形成种子的能力，但种子生活力较低。胚培养有可能促进这类种子萌发和形成幼苗。,四、影响胚培养的因素,（一）、培养基： 1无机盐 成熟胚的培养基较简单。主要有Turkey、Randolph、white等. 以大量元素和微量元素的无机盐为基本成分。 幼胚培养的培养基为常用的MS、B5、Nitsch以及Rijven、Rangaswang、Norstog等培养基。,2碳水化合物糖在胚培养中具有三个方面的作用：调节

7、培养基的渗透压、作为碳源和能源、防止幼胚的早熟萌发。,成熟胚在低浓度（含2%）蔗糖的培养基中生长很好。但幼胚 要求较高水平的碳水化合物。 未成熟胚加入蔗糖的最重要的作用是保持培养基适当的渗透压。如果蔗糖浓度过低易引起胚胎过早萌发。 Paris等（1953）在培养小于0.3mm的曼陀罗(D stramonium)胚时，发现其适宜的蔗糖浓度为5%，而较低的蔗糖浓度对较大的成熟胚生长适合。,3其它成分 氨基酸：谷氨酰胺、水解酪蛋白被广泛。 维生素类：有硫胺素、吡哆醇、烟酸、泛酸钙等。维生素对发育初期的幼胚的培养来说是必须的。 外源激素：成熟胚生长一般不需要即可萌发，而加入一定量的激素可显著增加培养物

8、的生长、并利于休眠种胚的萌发。 外源生长物质和植物内源激素之间某种平衡，是维持幼胚胚性生长的关键。如果激素浓度低，则不能促进其生长；如果激素浓度过高，将会使幼胚发生脱分化而影响其正常发育。 天然提取物：如椰乳、大麦胚乳、麦芽、马铃薯块、大豆等提取物，对胚生长有促进作用。 Van Overbeek等使用椰子汁培养曼陀罗的心形胚获得成功。 王伏雄（1963）发现蜂王浆对银杏幼胚正常分化有促进作用、胚 的死亡率减少、抑制胚形成愈伤组织。,（二）、环境条件 1温度 对大多数植物胚的培养来说，温度保持在2530较为合适。 而在20下马铃薯胚培养较好。在2530范围内柑橘、苹果、梨合适。 32时棉花胚生长

9、最好。桃则需要变温条件下进行。 2光照 光对胚胎发育有抑制作用，一般黑暗或弱光下利于幼 胚的培养。 （三）、 胚柄对幼胚培养的影响 研究表明，胚柄参与幼胚的发育过程。当胚发育到球形期时， 胚柄也发育到最大。 红花菜豆中，较老的胚，不管有无胚柄的存在，均能在培养基 中生长；但幼胚培养，不带胚柄会显著降低形成小植株的频率。,胚乳培养(endosperm culture)是指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的过程。 裸子植物中胚乳是由雌配子体发育而成的，是单倍体。 被子植物中胚乳一般是双受精的产物，是由两个极核和一个雄配子融合而成的三倍体。 而待宵草型胚囊只有一个极核与精

10、细胞融合，胚乳为2n。,第二节 植物胚乳的培养,一、 培养方法,（一）胚乳外植体的制备 将整个果实进行表面消毒，在无菌条件下切开幼果，取出种子，小心分离胚乳，接种在培养基上培养。 （二）胚乳愈伤组织再生植株 1愈伤组织的诱导 少数植物可以直接从胚乳分化出器官外，大多数被子植物的胚乳，无论是未成熟或成熟的，都首先形成愈伤组织，然后分化植株。 2器官发生途径 器官发生型和胚胎发生型均有。,（三） 三倍体后代的特征 1形态特征： 粗壮，叶片大而肥厚，叶色浓，花型大或重瓣，果实大但结实率低。 2胚乳再生植株的倍性 在胚乳培养中常常发生染色体倍性的混乱现象。即多数胚乳培养具有多种数目的染色体细胞组成。

11、黄贞光等（1982）报道，来源于猕猴桃同一植株的胚乳，可以培养出三倍体和二倍体两种倍性的植株。 影响胚乳细胞在培养中染色体稳定性的因素主要有： 胚乳的类型、胚乳愈伤组织发生的部位以及培养基中外源激素的种类和水平。,二、影响胚乳培养的因素,1培养基与培养条件 1）常用的基本培养基有MT、LS、MS等。 2）添加有机物，如水解酪蛋白和酵母提取物 3）同时加入细胞分裂素和生长素，愈伤组织正常生长，其效果显著优于使用单一的生长素或细胞分裂素。 4）蔗糖的浓度一般为3%5% 。 5）适宜培养温度为25左右,2胚在胚乳培养中的作用,胚乳培养中，分为：带胚培养、不带胚培养两种方式。 带胚培养胚乳比不带胚的胚

12、乳组织容易形成愈伤组织，当愈伤组织形成后，除去胚并不影响胚乳组织的增殖。 未成熟胚乳，在诱导培养基上没有胚的存在就能形成愈伤组织。而成熟的胚乳，必须借助于胚的萌发使其活化。胚对胚乳组织的增殖作用，被认为是某种“胚性因子”在起作用。这种“胚性因子”可能就是赤霉素。,三、胚乳培养的应用,1）三倍体幼苗和植株的获得，对于一些无性繁殖的植物具有重要经济价值。 2）胚乳植株染色体的不稳定性，为染色体工程的研究提供有效的途径。 3）为研究淀粉、蛋白质和脂肪等产物的生物合成及其代谢，提供了良好的实验系统。,第三节 植物胚珠和子房培养,一、胚珠培养 胚珠培养是将授粉的子房在无菌的条件下解剖后，取出胚 珠置于培

13、养基培养的过程。 胚珠是种子植物的大孢子囊，是孕育雌配子体的场所，也是 种子形成的前身。 根据培养胚珠的不同目的，可将胚珠培养分为受精胚珠的培 养和未受精胚珠的培养两种形式。,（一）胚珠培养的意义 1利用胚珠培养技术，对杂种在胚珠时期开始培养，可获得杂种植株，防止杂种胚早期败育。 2用未受精的胚珠培养以及未受精的胎座或子房培养可以作为试管受精的技术基础。 3在未受精的胚珠培养中可以诱导单倍体植株。,（二）胚珠培养方法 1材料的选择和灭菌 培养受精胚珠，取回授粉时间合适的子房；培养未受精的胚珠，则应在授粉前适当时间摘取子房。 进行常规表面消毒后，剥离子房，纵切开子房，将胚珠一个个取出来，或者将带

14、有胎座部分的胚珠一起取下接种。 2. 胎座和子房对胚珠培养的影响 带有胎座或子房的胚珠进行培养时，所需培养基较简单，而且受精后不久的胚珠也容易发育成种子。因此，在进行单个胚珠培养不能成功时，常可考虑用带有胎座或子房一起进行培养。,二、子房培养 子房培养是指将子房从母体上分离下来，放在人工配制的培 养基上，使其进一步生长发育成为幼苗的过程。 子房是雌蕊基部膨大的部分，由子房壁、胎座、胚珠组成。 （一）培养方法 1子房外植体的制备 子房培养的程序和方法与胚珠培养相似 2. 培养子房的发育 子房存在两种细胞，即性细胞和体细胞，它们都可产生胚状 体或愈伤组织，进一步发育成不同倍性的植株。 胚囊里的雌配

15、子体的核是由大孢子母细胞经过减数分裂发育 而来，产生的植株是单倍体。 如来源于体细胞，即由珠被和子房壁表皮二倍体组织产生的 植株，属于二倍体植株。,（二）影响子房培养的因素 受精前或受精后植物的子房，通过离体培养，都可形成果实，并得到成熟的种子。这种培养方式所要求的培养基也较简单，常用的培养基有N6、MS、NB等。 使子房性细胞和体细胞通过诱导胚状体或愈伤组织，并分化成植株，则对培养基的成分有一定的要求。如诱导未受精子房胚囊核单倍体组织发生，就需要在培养基中加入一定量的外源激素。,第四节 植物离体受精,一、植物受精 （一）植物离体授粉（pollination in vitro) 指将未授粉的胚

16、珠、子房或柱头从母体上分离下来，进行无菌培养，并通过一定的方式授给无菌花粉，使其在试管内实现受精的技术，又称为试管受精或离体受精（fertilization in vitro)。 优点： 离体授粉技术可以克服远缘杂交过程中受精前障碍， 获得可育性种子。 （二）根据授粉的部位分为三种离体受精技术： 胚珠授粉、子房授粉、柱头授粉。,1、离体柱头授粉： 将无菌花粉授于离体培养的雌蕊（未受精的）柱头上，得到含 有可育性种子或果实的技术,又称为雌蕊离体授粉。 2、离体子房授粉： 在离体条件下，将无菌花粉直接引入子房中，使花粉粒在子房 中萌发、完成受精，并获得具有生活力的种子的技术。 花粉粒引入子房中的方法： 直接引入法：在子房切口处，放入花粉粒。 注射法：将花粉粒用硼酸配成悬浮液，用无菌注射器注入子房中。 3、离体胚珠授粉： 在离体条件下，将无菌花粉在未受精的胚珠上授粉，得到可育 性种子的过程。,（三）离体受精的方法 1、试验材料的选择 实验最好选用子房较大并有多个胚珠的植物。 保留母体花器官组织有利于成功的离体受精。 2离体受精的一般程序 离体受粉程序是：确定开花、花药开裂的时间；去雄后将花蕾套袋隔离；制备子房或胚珠、采集花粉；试管授粉。 采集花粉：尚未开裂的花药可从花蕾中取出，置于无菌的培养皿中直到花药开裂；已开放的花中的花药，首先要进行表面消