工业微生物学实验多媒体课件(十个实验).ppt

1、微生物学实验,实验一,培养基的制备和灭菌,一、目的要求,学习和掌握各种培养基的制备方法，其中包括培养基的配制，包扎及灭菌技术。,二、基本原理,培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、生长因子以及水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适酸碱度范围内才能表现它们最大生命力，因此不同种类的微生物应将培养基调到一定pH值范围。培养基种类很多，不同的微生物所需培养基不同。按其组成可分合成培养基和天然培养基。按其物理状态可分固体培养基，液体培养基和半固体培养基。按其特殊用途可分加富培养基，选择培养基、鉴别培养基。,培养基配制后还必须进行

2、灭菌。灭菌和消毒是二个不同含义的名词。消毒是指消灭病原菌或有害微生物，而灭菌则是杀死或消灭一定环境中的所有微生物。,消毒与灭菌的方法很多，但总的可分为物理法与化学法两大类。物理法包括加热灭菌（干热灭菌与湿热灭菌），过滤灭菌、紫外线灭菌等。化学方法主要是利用有机或无机的化学药品对实验室用具和其它物体表面进行灭菌与消毒。,三、实验材料,每组同学需要准备以下材料（2人/组）： 小试管：12支（15*150mm） 培养皿：12套（9cm） 吸管：3支（1ml） 三角玻扒：2支 烧杯：1套（50ml，100ml，250ml，500ml） 量筒：1个（100ml） 玻棒：1支 分液漏斗：1套 药匙：2把

3、剪刀：1把 铁丝：数支 标签贴纸：1张 铅笔：1支 10ML玻璃吸管：1支,四、实验内容,（一）、培养基的配制： 同学们先将试管贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签粘贴位置在离管口1/3管身处。 注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。 操作图示：,培养基配方：,四、实验内容,肉汤培养基：营养肉汁1g 自来水50ml PH7.2 麦芽汁培养基：麦芽汁5g 自来水50ml 自然PH 固体培养基：由液体培养基加2琼脂,1配制肉汤斜面培养基50 mL 将小烧杯置天平上，用药匙取营养肉汤干燥培养基，称取1 g先加少量自来水，溶解彻底再转移到量筒，定容至50ml，然后倒在250 mL烧杯

4、里，加入琼脂1g（2%），浸泡于液体培养基里，液面位置做好标记，在电炉上加热融化后（注意补充蒸发的水分以保持原体积不变），用分液漏斗分装6支小试管，每支5 mL左右（约试管高度的1/5左右）， 用硅胶塞塞好试管口，再用防潮纸和棉绳将试管塞罩住扎成一捆。 图4-10 用漏斗分装培养基及摆斜面 2配制麦芽汁斜面培养基（方法同上）,四、实验内容,3注意事项： 本实验使用调配好的“干燥培养基”，这种培养基是将新鲜配制的液体培养基用喷雾干燥法，真空干燥法，低温干燥法或蒸发干燥法等将培养基内所含的水分去掉；或将培养基内的各种固形成分，经适当处理，充分混匀，便成干燥粉末而成。使用时只要按比例加入一定量的水，

5、经溶解，无需调pH，分装，高压蒸汽灭菌，即可使用。 “干燥培养基”成品很容易吸潮，在称量时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再取另一种药品。瓶盖也不要盖错。 在烧杯融化琼脂的过程中，人要在电炉旁看着，以免培养基因沸腾而溢出烧杯。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。注意带上棉纱手套防止烫伤。 分装过程中，注意不要使培养基沾在管口上，以免沾污棉塞而引起污染。,四、实验内容,（二）培养基灭菌 培养基分装好后，塞上棉塞，外面再包一牛皮纸，便可灭菌。灭菌的时间和温度按各培养基规定进行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。培养基经灭菌后，可放在

6、37恒温箱培养24小时，无菌者方可使用。 在实验室里用得最多的加热灭菌法是高压蒸汽灭菌和干热灭菌。一般培养基和灭菌水等用高压蒸汽灭菌，而玻璃器皿常用干热灭菌。蒸汽灭菌为105-121，15-20分钟，干热灭菌为160-170，1-2小时。目的都是使细菌体内蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 在同一温度下，湿热杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固，同时湿热穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触凝成水分时，又可放出热量，使温度迅速增高，从而增加灭菌效力。,四、实验内容,（三）包扎 1培养皿：以旧报纸密密包紧，一般以6套做一包，待灭菌。 2吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处

7、，塞一小段1.5cm长的棉花。棉花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会下滑），然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端，与报纸约呈60角，并将右端多余的报纸打一小结。 3三角玻扒：跟包扎吸管相似，将三角部分斜放在报纸条的近左端，与报纸约呈45角，并将右端多余的报纸打一小结。,四、实验内容,五、实验报告,思考题： 培养基应具备哪些条件? 在培养基配制操作过程中应注意什么问题?为什么? 培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养 基是无菌的? 高压蒸汽灭菌的关键为什么是高温而不是高压?高压蒸汽灭菌 前为什么要将灭菌锅内的冷空气排尽?灭菌完毕后什么情况下 才可以

8、开锅盖取出灭菌物品? 玻璃器皿为什么在灭菌前要先行干燥? 对含糖(如含葡萄糖或乳糖等)培养基进行高压蒸汽灭菌时， 应采用多大压力，多长时间灭菌为宜? 加热蒸汽灭菌为什么比干热灭菌所要求的温度低、时间短？ 干热灭菌完毕后，在什么情况下才可开箱取物？为什么？,实验二,微生物的接种,一、目的要求,训练微生物接种的基本技能 基本建立无菌操作的概念,二、基本原理,接种技术是微生物学实验及研究中的一项最基本的操作技术。接种是将纯种微生物在无菌操作条件下移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。为了获得微生物的纯种培养（指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代），要

9、求接种过程中必须严格进行无菌操作，一般是在无菌室内，超净工作台火焰旁或实验室火焰旁进行。,根据不同的实验目的及培养方式可以采用不同的接种工具和接种方法。常用的工具有接种环、接种针、接种铲、玻璃涂棒，移液管及滴管等。常用的方法有斜面接种，液体接种，穿刺接种和平板接种，这些方法在后面的实验一一进行训练。,三、实验材料,1各组所需的物品 接种用具：接种环（针、钩），酒精灯，镊子，消毒棉球，打火机， 标签贴纸，废物杯，一次性口罩，纸巾。 准备移植的菌种：参考下列接种菌名（由老师提供） 斜面培养基：肉汤培养基（6支），麦芽汁培养基（6支） 为下次实验制备培养基的工具：参考实验一 2注意事项： 酒精不足的

10、酒精灯请自行添加！注意：添加量不得超过容量的2/3。 将所有空白斜面贴好标签，注明接入菌种的名称，接种班别，接种组别， 接种日期。 接种前请将台面用抹布清洁，擦干；双手用洗手液清洁，擦干。 斜面接种，分清菌台和培养基，挑取少量菌种，切勿划破培养基。 接种时要关闭门窗，风扇，人不要随意走动，端坐，平缓呼吸。 不同的菌种，不同的接种方式，使用不同的接种工具（针，钩，环，吸管）。,四、实验内容,1微生物的斜面接种技术： 从已长好微生物的菌种管中挑取少许菌苔接种至空白斜面培养基上的过程。 斜面接种的操作方法： （1）操作前，先用75%酒精擦手，作表面消毒，待酒精挥发后才能点燃 酒精灯。（可通常是点燃酒

11、精灯再用酒精擦手。） （2）用斜面接种时，将菌种管和斜面管握在左手的大拇指和其他四指之 间，使斜面和有菌种的一面向上，并处在水平位置。 （3）先将菌种管和斜面管的试管塞旋转一下，以便接种时便于拔出。 （4）右手拿接种环，拿的方式与普通日常拿笔一样。将要伸入试管部分 的金属柄和金属丝在酒精灯火焰上灼烧灭菌。 （5）用右手小指、无名指或手掌将菌种管和斜面管的试管塞同时拔出， 并把塞子握住，不得任意放在桌上或与其他物品接触，再以火焰烧 管口。 转下页,（6）将上述在火焰上灭菌过的接种环伸入菌种管内，使接 种环在接种菌种前先在试管内壁上或空白培养基接触 一下，使接种环充分冷却，以免烫死菌种然后用接种

12、环在菌落上轻轻地接触，刮取少许后将接种环自菌种 管内抽出。抽出时勿与管壁相碰，也勿使再通过火焰。 （7）迅速将沾有菌种的接种环伸入斜面培管中，在斜面上， 自下而上划线，使菌种沾附在培养基上，划线时勿用 力，否则会使培养基表面划破。 （8）接种完毕后将接种环抽出，灼烧管口，塞上试管塞。塞 试管塞时勿要用试管口去迎试管塞，以免试管在移动时 侵入杂菌。 （9）接种环在放回原位前，要经火焰灼烧灭菌。同时须将试 管塞进一步塞紧以免脱落。,接种菌名及接种划线方式、接种工具： 细菌：枯草杆菌，大肠杆菌，单球菌，谷氨酸菌，假单孢杆 菌，巨大芽孢杆菌（6支） （接种方式：“之”字划线，接种工具：接种环） 霉菌：

13、黑曲霉，黄曲霉，根霉（3支） （接种方式：点植或划直线，接种工具：接种钩或接种环） 酵母菌：面包酵母菌，古巴酵母菌，假丝酵母菌（3支） （接种方式：划直线，接种工具：接种环）,图4 11 各种无菌操作接种技术示意图,图4 11 各种无菌操作接种技术示意图,图2-1 各种无菌操作接种技术示意图,图2-2 穿刺接种操作过程示意图,将接种好的斜面试管置最适合该菌种生长的恒温培养箱里。 一般细菌于37恒温培养箱培养1-2d 一般霉菌和酵母菌于32恒温培养箱培养2-3d,2生物的培养技术 培养箱恒温培养法,3. 为下次实验准备平板培养基： 各组同学先三角瓶贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签粘贴位

14、置在离瓶口1/3瓶身处。注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。 培养基配方：肉汤培养基：营养肉汁2g 自来水100 mL PH7.2 麦芽汁培养基：麦芽汁10g 自来水100 mL 自然PH 固体培养基：由液体培养基加2琼脂 (1)配制肉汤平板培养基100 mL 将小烧杯置天平上，用药匙取营养肉汤干燥培养基，称取2 g加少量自来水，溶解彻底转移到量筒，定容至100 mL，再装入250 mL三角瓶，加入琼脂2 g，浸泡于液体培养基里，用棉塞塞好瓶口，再用防潮纸和棉绳将棉塞罩住扎好。 (2)配制麦芽汁平板培养基（方法同上） 配制好的培养基进行灭菌！,五、实验报告,1观察记录实验结果:微

15、生物琼脂斜面上的生长状况。 2思考题: 接种环(针)接种前后灼烧的目的是什么?为什么在接种前一定要将其冷却？如何判断灼烧过的接种环已冷却? 培养不同种类微生物能否用同一种培养基?为什么?细菌、酵母菌、霉菌通常用什么培养基培养？,实验三,微生物的分离纯化技术,一、目的要求,学习从混杂的微生物群体中分离与纯化微生物 菌种的方法。 综合练习微生物学实验的各种无菌操作技术,二、基本原理,自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。 微生物的分离、纯化技术是指从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的

16、过程。微生物的平板分离纯化技术自1880年被发明以来以有100多年的历史，该技术的建立和发展为人类获得丰富的微生物资源以及在工、农、医、环境、动物细胞培养等方面的应用作出了巨大的贡献。平板稀释涂布、平板稀释混合、平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法。 分离纯化技术其实是进行平板接种，即用接种环将菌种接至平板培养基上，或用移液管、滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上，然后培养。平板接种的目的是观察菌落形态，分离纯化菌种，活菌计数及在平板上进行各种实验时采用的一种接种方法。 本实验是利用分离纯化技术来获得三大类微生物的平板纯培养物，为下次实验微生物的形态观察提供菌落形态的部分（形态观察主要包括群

17、体形态（菌落形态）和个体形态观察两个方面。,三、实验材料,1、各组所需物品： 无菌培养皿：两包，12套 无菌三角玻扒：1支 无菌吸管：3支 接种器具：酒精灯，镊子，消毒棉球，打火机，标签贴纸，圆珠笔， 一次性口罩，纸巾。 制平板的培养基：肉汤琼脂培养基（1瓶）, 麦芽汁琼脂培养基（1 瓶） (于杀菌锅里保温) 2、平板的制备： 将融化的琼脂培养基,冷却至50左右(以手背能忍受的温度为准)温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于45时，培养基易于凝固而无法制作平板。 平板的制作应在酒精灯火焰旁进行，右手掌心握住三角瓶的底部，左手打开三角瓶棉塞，以右手的无名指和末指夹持瓶塞，灼烧瓶口。左手拿培养皿

18、，用左手的大拇子将皿盖掀开一缝，至瓶口刚好伸入，向皿内注入培养基（约15 mL,厚度约0.5 mL左右），迅速盖好皿盖。 左手持培养皿稍加旋转摇动，使培养基均匀分布于整个培养皿底部，然后平置于桌面水平位置,待凝后即为平板。,四、实验内容,1. 平板混合分离法：大肠杆菌，枯草杆菌，单球菌（3皿） 将菌液分离样品摇匀，用无菌移液管取1 ml的菌液移至无菌培养皿中，然后将融化，凉至50左右的培养基，在每个培养皿内各倒入约15 ml，摇匀，凝固，制成平板。 图3-1 混合倒平板操作法示意图,四、实验内容,2. 平板划线分离法：（3皿） 将菌液分离样品摇匀，以无菌操作用接种环直接取试管中待分离纯化的菌液

19、，将菌液点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余的菌种。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙（约30）伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却,然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30-40，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,接种环不要嵌入培养基内划破培养基,线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划线完毕，关上皿盖.灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。,图3-2 平板划线分离操作法示意图,图3-3 平板划线菌落分离效果图,3. 平板涂布分离法(3皿)：面包酵母菌，古巴酵母菌，假丝酵母菌 将菌液分离样品摇匀，将0.1ml菌悬液小心地滴在平板

20、培养基表面中央位置。右手拿无菌三角玻扒在平板培养基表面上,将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直来回推动,平板内边缘处可改变方向用三角玻扒再涂布几次。,四、实验内容,图3-4 涂布平板操作法示意图,四、实验内容,4. 平板点殖：黑曲霉，黄曲霉，根霉 （3皿） 一般用于观察霉菌的菌落。在无菌操作下， 用接种针从斜面或孢子悬液中取少许孢子，轻轻 点种于平板上。,四、实验内容,5. 生物的培养技术：培养箱恒温培养法 细菌于37恒温培养箱培养1-2d，平板倒置培养。 霉菌和酵母菌于32恒温培养箱培养2-3d，平板 倒置培养。,五、实验报告,1、观察记录实验结果：微生物

21、的菌落特征 注:菌落特征描写方法参考如下： 大小：大，中,小,针尖状 形态：圆形，不规则等 干湿情况：干燥，湿润，粘稠 高度：扁平，隆起，凹下 透明度：透明度，半透明，不透明 颜色：黄色，金黄色，灰色，乳白色，红色，粉红色，黑色等 边缘：整齐，不整齐,2、思考题: 如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤. 你所做的涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落?如果不是,请分析其原因。 在恒温培养箱中培养微生物时为何培养皿需倒置?,五、实验报告,实验四,微生物的制片技术及基本形态的观察,一、目的要求,识别各种细菌、酵母菌及霉菌的菌落特征 2. 学会细菌、酵母菌及霉菌的一般制片方法

22、 3. 观察并掌握细菌、酵母菌及霉菌的个体形态及生长繁殖方式 4. 熟练掌握显微镜低倍、高倍物镜及油镜的使用技术,二、基本原理,微生物的形态观察包括个体形态观察和群体形态观察（菌落特征观察）。 微生物的个体形态都很小，必须借助显微镜，如相差显微镜，电子显微镜，光学显微镜才能看清。一般实验室常用普通光学显微镜。 细菌细胞小而透明，如果菌体和背景没有较大的明暗度差别，是很难看清它们的形态的，更不易于识别其结构，所以，观察细菌时，往往要将细菌进行染色，借助颜色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及某些细胞结构。因此，微生物的染色及形态结果的观察是微生物学实验中十分重要的基本技术。微生物细胞染色的

23、的基本原理是根据物理因素和化学因素的作用。物理因素包括细胞及细胞质对染料的毛细现象、渗透、吸附、吸收作用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生的化学反应。一般酸性成分对碱性染料较易吸附，而且较稳定。同样，碱性成分对酸性染料也较易吸附，而且也较稳定。 转下页,二、基本原理,酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，大多数以出芽方式进行无性繁殖，本实验通过美蓝染液水浸片来观察酵母的形态。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是

24、无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。 霉菌的菌丝体及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。观察霉菌的形态有多种方法，本实验让同学练习直接制片观察法，再介绍载片培养观察法。直接制片法是将培养物置于乳酸石炭酸液中，制成霉菌制片镜检。制成的霉菌制片的特点是：细胞不变形；具有防腐作用，不易干燥，能保持较长时间；能防止孢子飞散。载片培养方法是用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。,三、实验材料,1. 菌种：细菌，酵母菌，霉菌各3种，由上次实验提供（同学们自

25、制的12皿平板） 2. 每组制片用具：接种工具1套，载玻片9片，盖玻片6片，玻片架3个，吸水纸（或纸巾），一次性口罩，一次性手套，保鲜袋，吹风筒，显微镜 3. 染色剂1套：革兰氏A、B液，沙黄，乙醇，无菌水，乳酸石炭酸，二甲苯，美蓝，冲洗蒸馏水1瓶,四、实验内容,观察上次实验结果记录：细菌、酵母菌、 霉菌的菌落特征。 显微镜的构造、性能和使用方法。,图4-1 普通光学显微镜,图4-2 普通光学显微镜的构造,图4-3 研究型(相差、荧光)显微镜,图4-4 相差显微镜的成像原理,图4-5 显微镜的光路,图4-6 大肠杆菌,图4-7 黑霉,图4-8 正在分裂的细菌,图4-9 孢子与酵母,四、实验内容

26、,细菌、酵母菌、霉菌的制片技术及 个体形态观察： （戴上一次性口罩） 革兰氏染色法（各1片）：枯草杆菌，大肠杆菌 和单球菌 美蓝染色（各1片）：面包酵母菌，古巴酵母菌 和假丝酵母菌 乳酸石炭酸浸片（各1片）：根霉，黄曲霉和 黑曲霉,A. 加小滴水,B. 涂成薄层,C. 固定菌体,图4-10 涂片制备过程,四、实验内容,革兰氏染色注意载玻片要洁净，滴无菌水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不宜过厚；热固定温度不宜过高，（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态；水洗时不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，过大，以免涂片薄层脱落。 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏

27、染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌。 美蓝染色注意染液不宜过多或过少，否则在盖上盖玻片的时,菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察；同样，盖玻片的不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。 霉菌直接制片注意挑菌和制片时要小心，尽可能保持霉菌的自然生长状态，加盖玻片时勿压入气泡，以免影响观察。,4 注意事项：,五、实验报告,1绘图说明你所观察到的细菌，酵母菌，霉菌的个体形态特征（共9个） 绘图示例： 枯草杆菌G+ 放大倍数：10100,五、实验报告,2思考题： 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 现有一株细菌宽度明显大于大肠

28、杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。 你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色出现什么问题？ 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色?你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？,实验五,微生物生长，数量及大小的检测,一、目的要求,学会用血球计数器测定酵母菌细胞数 学习和掌握用测微尺测量微生物细胞大小的方法,二、基本原理,微生物个体生长的时间较短，很快进入分裂繁殖阶

29、段，个体生长难以测定。它们的生长一般以繁殖即群体生长作为微生物生长的指标。群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定数目的方法有显微镜直接计数法、平板计数法、光电比浊法等。 显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具即测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。,三、实验材料,酵母菌液 显微镜、血球计数器、目镜测微尺、镜台测微尺 3. 载玻片、盖玻片、接种环、胶头吸管等,图5-1 Tho

30、ma血球计数板 A.正面图 B.纵切面图 1.血球计数板 2.盖玻片 3.计数室,16小格 25大格计数室,25小格 16大格计数室,图5-2 计数室的两种刻度形式,四、实验内容,一.酵母菌数量的检测 1. 显微镜直接计数法（每人1片） 注意事项: 取样时先要摇匀菌液;加样时计数室不可有气 泡产生。 B. 调节显微镜光线的强弱适当。 2. 平板菌落计数法 (实验八),四、实验内容,二.酵母菌大小的检测 注意事项：观察时光线不宜过强,否则难以找到镜台测微尺的刻度;换高倍镜和油镜校正时,务必十分小心,防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。 1.测微尺的校正（标定）： 两重合线间镜台测微尺格数10 目

31、镜测微尺每格长度(m)= 两重合线间目镜测微尺格数 2酵母菌大小的测定： 利用制好的血球器浸片，用高倍镜测出宽和长各占目镜测微尺的格数，再将测到的格数乘以目镜测微尺（用高倍镜时标定的）每格所代表的长度，即为酵母菌的实际大小。,四、实验内容,三.准备下次实验的培养基和玻璃器皿 淀粉平板培养：6瓶，100ml/瓶（肉汤培养基+可溶性淀粉） 明胶液化培养基：30支，5ml/支（肉汤培养基+明胶12%-18%） 糖类发酵培养基(加杜氏小管)：30支，5ml/支 蛋白胨水：30支，5ml/支 培养皿：36皿，包成6包，6皿/包,五、实验报告,1、结果记录： (1)将计数结果记录下表。A表示五个中方格中的

32、总菌数。B稀释倍数为102。,注:1 mL菌液总数=A/525104B=5107A,五、实验报告,（2）将目镜测微尺校正结果填入下表: 接目镜放大倍数：-10-,五、实验报告,(3)将酵母菌大小测定结果填入下表：,五、实验报告,2.思考题： 根据你的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方 面？应如何尽量减少误差，力求准确？ 某单位要求知道一种干酵母粉的活菌存活率，请设计1-2种可行 的检测方法。 比较平板菌落计算法和显微镜下直接计算法的优缺点几应用。 在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测 定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？ 为什么更换不同放大倍率目镜和物

33、镜时，必须用镜台测微尺重 新对目镜测微尺进行校正？,实验六,微生物的生理生化反应,一、目的要求,了解不同细菌对含氮及含碳化合物的分解和 利用情况 进一步掌握微生物的接种方法,二、基本原理,微生物代谢与其他生物代谢有着许多相似之处，也有不同之处。微生物代谢重要特征之一，就是代谢类型的多样性，因此使得微生物在自然界的物质循环中起着重要的作用，同时也为人类开发利用微生物资源提供更多的机会与途径。人们在微生物的分类鉴定工作中，常利用其生理生化反应作用作为重要依据。 本实验分别安排微生物对生物大分子的分解利用（淀粉水解实验水解试验、明胶液化试验），对含碳化合物的分解利用（糖发酵试验）以及对含氮化化合物的

34、分解利用（吲哚试验），让同学们对微生物的代谢类型多样性有一个初步和感性的了解，同时学习利用微生物形态、结构以及生化反应的特征对某些细菌进行初步的分类。 本实验进一步学习平板接种法、穿刺接种法、液体接种法。,三、实验材料,1培养基： 淀粉水解培养基：2皿 明胶液化培养基：2支 糖类发酵培养基：4支 蛋白胨水培养基：2支 2. 接种用具：接种环（针、钩），酒精灯，镊子，消毒棉球，打火机，标签贴纸，废物杯，一次性口罩，纸巾，油性笔。 3. 实验菌种：枯草杆菌、大肠杆菌、单球菌 4. 配置培养基的工具：1套,四、实验内容,图6-1 糖类发酵试验,四、实验内容,操作步骤： 1. 淀粉水解试验：（2皿）

35、（1）翻转平板使底皿背面向上，用油性笔在其背面玻璃上画上三 个圆圈。 （2）用接种环在圆圈中间以点植的方式接上菌种。一皿接枯草杆 菌，另一皿接大肠杆菌。 （3）将接完种的平板倒置于37恒温培养箱，培养24h。 （4）观察结果时，可打开皿盖，滴加少量的碘液于平板上，轻轻 旋转，是碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明 圈，则说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小，说明该 菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外酶活力的高低。（以 “+”、“”表示有无透明圈）,四、实验内容,（1）以穿刺接种法分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于明胶培 养基中。 （2）接种后置于20恒温培养箱，培养2-5d。 （3）观察结果

36、时，注意培养基有无液化现象。（以“+”、 “”表示有无液化现象） 注意： 如果细菌在20时不能生长，则必须培养在所需的最适温度下，观察结果时需将试管从恒温箱里取出，置于冰浴中，才能观察液化程度。,2. 明胶液化试验：（2支）,四、实验内容,（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于 同种糖类培养基中，以作比较。 （2）接种后置于37恒温培养箱，培养24h。 （3）观察结果时，看各管颜色变化及杜氏小管有无气 泡。产酸产气用“”表示；只产酸不产气用“+”表 示；不产酸也不产气用“”表示。,3. 糖类发酵试验：（4支）,四、实验内容,（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于蛋 白胨

37、水培养基中。 （2）接种后置于37恒温培养箱，培养24h。 （3）观察结果时，在培养液中加入乙醚约1毫升（使呈明显 的乙醚层）。充分振荡，使吲哚溶于乙醚中，静置片 刻，待乙醚浮于培养液上面时，沿管壁慢慢加入吲哚 试剂10滴。如吲哚存在，则乙醚层呈玫瑰红色 （注意：加入吲哚试剂后，不可再摇动，否则红色不明 显）。以“+”、“”表示有无红色的玫瑰吲哚。,4. 吲哚试验：（2支）,四、实验内容,肉汤培养基：100 mL，装在250 mL三角瓶（加入1.5%琼脂） 乳糖胆盐发酵培养基：100 mL分装10支大试管(加杜氏发酵 管)，10 mL /支 生理盐水：250 mL,其中225 mL装在500

38、mL三角瓶(加适量玻 珠)；18 mL分装2支大试管，9 mL /支，剩余的丢弃 吸管：2支10 mL，5支1 mL 培养皿：6皿,准备实验七的培养基和玻璃器皿：,五、实验报告,1. 细菌对各种生理生化试验反应的原理：,五、实验报告,2细菌对各种生理生化试验反应的结果：,五、实验报告,（1）淀粉、明胶等生物大分子物质能否不经分解而直接被细菌吸 收？为什么？ （2）接种后的明胶试管可以置于37恒温培养箱箱中培养，在培 养后你必须做什么才能证明水解的存在？ （3）假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什 么结果？ （4）解释在细菌培养中吲哚试验的化学原理，为什么在这个试验 中用吲哚的存

39、在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？,2. 思考题,实验七,水和食品中微生物的检测,一、目的要求,了解食品卫生微生物学的重要性及其原理 学会水和食品中细菌菌落总数的测定方法和平板活菌计数法 3. 学会水和食品中大肠菌群数的测定方法,二、基本原理,水和食品中的微生物数量主要考虑到的是细菌特别是病原菌的数量。这些细菌主要来源于土壤、垃圾、粪便等，尤其是后者。若饮用水、酿造水和食品中发现有大肠群细菌，就有可能存在肠道病原菌，可能会危害人们的健康，因此，进行食品卫生的微生物学检验是十分重要的。 一般情况下，主要是测定水和食品中细菌菌落总数和大肠菌群数。细菌菌落总数是指水中或食品检样经处理后，在一

40、定条件培养后，所得1 g或1 mL检样中所含细菌菌落的总数，其主要作为判定水和食品被污染程度的标志。大肠菌群是肠道最普遍存在和数量最多的一群细菌、常将其作为人畜粪便污染的标志。水和食品中大肠菌群数是以每100 mL（g）检样中大肠菌群最可能数（MPN）表示的。,三、实验材料,水样的采取： 池水，河水或湖水应距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中,盛满后,将瓶塞盖好,再从水中取出,最好立即检查,否则需放入冰箱保存,时间不要超过六小时。 2. 其他实验材料参考实验讲义P47,四、实验内容,（一）、食品中细菌菌落总数和大肠菌群数

41、的检测 食品中细菌总数：用平板菌落计数法测定（即菌种分离纯化技术的平板混合法） 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞,取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品的一个单细胞.统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以,长成的一个单菌落也可能来自样品中2-3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果,现在已倾向使用菌落形成的单位(colony-forming units,cfu)而不以绝对菌

42、落数来表示样品的活菌含量。,四、实验内容,2食品中大肠菌群数: 用多管发酵法测定.包括初(步)发酵试验,平板分离和复发酵试验三个部分(略) 发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基,并倒置一杜氏发酵小管.乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖,而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气.为便于观察细菌产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为PH指示剂,细菌产酸后,培养基即由原来的紫色变为黄色.溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。,图7-1 食品检样稀释及倾注平板示意图,四、实验内容,操作图示：,四、实验内容,（二）、准备下次实验培养基（P30-31） (1)肉汤琼脂培养基：100 mL，装在250 mL三角

43、瓶(加2%琼脂) (2)肉汤上层培养基：50 mL，分装8小试管，每支5 mL（1/4试管） （加0.8%琼脂） (3)蛋白胨水：30 mL分装5支小试管,每支4.5 mL (4)吸管：1 mL6支 (5)培养皿：12皿，包成两包，6个/包 （三）、观察上次实验结果记录,五、实验报告,1食品微生物学检测结果的报告(格式)： 微生物学检测结果的报告 送检单位:有限公司 送检样品: 检测项目:细菌总数和大肠菌群数 检测方法: (1)食品中细菌总数: 用平板菌落计数法测定.(根据国标GB47892-94) (2)食品中大肠菌群数: 用多管发酵法测定.(根据国标GB47893-94) 检测结果: (1

44、)食品中细菌总数检测结果: (2)食品中大肠菌群数检测结果:阳性结果记“+”;阴性结果记“_”。一支管一个记号。 结论: 检测单位:华工生物工程级 检测人(报告人): 日期:200-,五、实验报告,2.思考题 为什么融化后培养基要冷却至50左右才能倒平板？ 要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？ 试比较平板菌落计数法和显微镜直接计数法的优缺点及应用。 当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时， 你认为问题在哪里？ 用倾注平板法和涂布平板法计数，其平板上长出的菌落有何不 同？为什么要培养较长时间（48小时）后观察结果？ 大肠菌群的定义是什么？ 大肠菌群中的细菌种类，一般并

45、非是病原菌，为什么要选用大 肠菌群作为食品被污染的指标？,实验八,噬菌体效价的测定,一、目的要求,学会噬菌体的检查及其效价测定方法 学会观察识别噬菌斑,二、基本原理,噬菌体的效价就是1 mL培养液中所含活噬菌体的数量。效加测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体长生肉眼可见的噬菌斑。因此，能进行噬菌体的计数。但因噬菌斑计数方法其实效率难以接近100%（一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染），所以为了准确地表达病毒菌悬液的浓度（效价）一般不用病毒粒子的绝对数量而是用噬菌斑形成单位（plague-forming units，简写成pfu）,三、实验材料,

46、菌种 （1）噬菌体待检液的制备：参照实验讲义P35 （2）指示菌液的制备：参照实验讲义P35 培养基及玻璃器皿 已在实验七预先准备 其它器材 水浴锅、电炉、酒精灯、接种环等,四、实验内容,图8-1 平板点滴法噬检操作过程,四、实验内容,图8-2 单层琼脂法噬检操作过程,四、实验内容,图8-3 双层琼脂法测定噬菌体效价操作过程,四、实验内容,1、噬菌体的效价 双层法： (每组做3个稀释度，每个稀释度做2皿；另加对照1皿， 共7皿) 注意事项： 噬菌体对温度极其敏感，一般噬菌体60下5分钟绝大部分失活.因此加入上层培养基的温度要严格保持50以下，为防止琼脂凝固,此步操作要快,均匀铺满，不能出气泡。

47、 为保证获得单一，彼此分离的噬菌斑，培养皿盖上和培养基表面不得有凝结水滴。正置培养，不能倒置。每皿噬菌体数量不能太多，维持100-300个为宜,否则噬菌斑不能分开而连成一片。 同组同学分工合作协调好，一位稀释噬菌体同时移噬菌体液以及移指示菌液；一位倒制底层平板同时拿上层试管接好移液。,四、实验内容,噬菌体效价测定操作图示:,四、实验内容,2、准备下次实验配培养基和玻璃器皿(每实验台) 1）完全培养基 2）再生培养基 3）生理盐水 4）缓冲液 A.0.1mol/L,PH6.0磷酸缓冲液. B.高渗缓冲液,于上述缓冲液中加入0.8mol/L甘露醇 5）原生质体稳定液(SMM) 5mol/L蔗糖,2

48、0mol/LMgCl20.02mol/L顺丁烯二酸,调PH6.5 6）促融合剂 40%聚乙二醇(PEG-4000)SMM溶液 7）玻璃器皿包扎： A培养皿：18皿，6皿/包，包成3包 B小试管：20支 C吸嘴：1盒（约60个） 3、观察上次实验结果,五、实验报告,1、记录双层平板上的噬菌斑数目，计算噬菌体效价,注:噬菌体校价=pfu数稀释倍数10,五、实验报告,2、思考题： 测定噬菌体的效价，操作时要注意些什么才能测 定准确？ 计算噬菌体效价时，选择30-300个pfu的平板计 数较好，为什么？ 如果在你的测定平板上，偶尔出现其他细菌的 菌落，是否影响你的噬菌体效价测定？,大型综合实验一,酵母

49、菌原生质体 诱变育种,一、目的要求,1观察酵母菌子囊孢子的形成及学习酵母单倍体营养细胞 的制备方法； 2学习酵母原生质体的制备过程； 3掌握用化学诱变剂处理原生质体的操作方法； 4学会营养缺陷型筛选和鉴定的一般方法； 5综合训练微生物学实验的操作技能和科研能力。,二、基本原理,在高渗压溶液中，用酶法将细胞壁分解除掉，剩下由原生质膜包住的球状胞体，称为原生质体（Protoplast）。它保持了原细胞的一切活性。 原生质体诱变的原理是利用原生质体因去掉细胞壁屏障而对诱变剂的敏感性强和变异率高的特点来选育人们需要的变异菌株，是菌种选育的一种行之有效的方法。 原生质体可采用物理或化学因素诱发其基因的突

50、变。化学诱变剂N -甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（简称亚硝基胍，NTG）对诱变选育营养缺陷型非常有效。 营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质的能力，必须在其培养基中加入相应的营养成份才能正常生长的变异株。与其相对应的是野生型菌株。营养缺陷型在生产和研究上用途很广，目前生产氨基酸和核苷酸的菌种大多是各种类型的营养缺陷型。要研究代谢途径，要进行原生质体融合育种或其它重组育种技术，一般都必须有营养缺陷型的菌株为研究材料。 本实验拟以两种不同性状的酵母菌（双倍体）为出发菌株，先获得其单倍体细胞，再分别制备其原生质体。然后采用亚硝基胍进行化学诱变处理，由再生菌落中检出营养缺陷型，再确定其生

51、长谱。所获得的精确营养缺陷型可作为原生质体融合育种的亲本菌株。,三、实验材料,（一）出发菌株 1酵母菌A：耐高温酒精酵母（双倍体，能产生子囊孢子） 2酵母菌B：高糖面包酵母（双倍体，能产生子囊孢子） （二）培养基 已在实验八预先准备 （三）试剂 1. 缓冲液、生理盐水及原生质体稳定液已在实验八预先准备 2. 1 mol/L巯基乙醇 3. 蜗牛酶：用高渗缓冲液配成50 mg/mL溶液 4. 1 mg/mL亚硝基胍(NTG)：用缓冲液B配成1 mg/mL溶液 （四）器具 显微镜、水浴锅、培养箱、离心机、摇床、超净台、各种常用玻璃器皿,四、实验内容,（一）酵母子囊孢子的获得与观察 1将酵母斜面种接入

52、麦汁锥瓶中，振荡培养1824小时， 离心、洗涤、得菌体。 2将菌体大量涂布于醋酸钠琼脂斜面上置2528培养3 天以上，使产生子囊孢子。 3镜检观察子囊孢子的形态和数目。,四、实验内容,（二）单倍体酵母的分离制备 法一：用高渗缓冲液洗下醋酸钠斜面上的菌体，加入1蜗牛酶作用4060分钟。离心得菌体，加入少量硅藻土并用玻璃棒搅磨使子囊孢子分散。加入高渗液，搅匀静置，取上清液涂布CM平板进行分离培养后选取最小菌落接入CM斜面保存，若在醋酸钠斜面上不产孢者则为单倍体。 法二：该法是根据子囊孢子比营养细胞更耐热的特性，用热处理法分离单倍体菌株的。首先将酵母营养细胞悬液（约 10-6 个/ml )浸于55

53、60恒温水浴中加热（不断振荡），每隔2分钟用接种环醛取菌液接种于平板上。（约需10分钟）。然后将平板置30培养2天，以确定完全不生长或只有一两个菌落生长的处理条件。按着，从生孢子斜面上取菌体进行同样条件的处理，到时间后迅速冷却，经适当稀释后进行平板分离培养2天，挑取较小圆锥形菌落保存于斜面，再进行镜检纯化鉴定。,四、实验内容,（三）单倍体酵母原生质体的制备 1将单倍体酵母接入CM锥形瓶中，置30 振荡培养20小时，吸取2 mL菌液接入30 mL新鲜的CM液中，继续振荡培养6小时。 2上述菌液于3000转分离心10分钟，用无菌生理盐水洗涤两次，调整并制成约10-8个/mL的菌悬液。 3于无菌离心

54、管中加入： （1）菌悬液2 mL ； （2）1 mol/ L巯基乙醇0.1 mL； (3）缓冲液C0. 4 mL ； （4）混合盐液1.6 mL ； （5）蜗牛酶1 mL （浓度1）。置30 水浴中处理约60分钟，镜检。4以3000转分离心5分钟去酶，用高渗缓冲液B珠洗涤原生质体两次，恢复原体积，振荡分散制成原生质体悬浮液。用血球计数器于显微镜下直接观察并计算原生质体形成率。,四、实验内容,（四）用亚硝基胍（NTG）诱变处理酵母 原生质体 1吸取上述原生质体悬浮液lml，加入0.2 lml亚硝基胍溶 液（处理浓度为0.150.5mg/ml），于30振荡处理 3060分钟。 2用高渗缓冲液B稀释

55、1000倍中止作用。 3用同样缓冲液作适当稀释后涂布在高渗再生培养基平板 上，于30培养数天，观察再生菌落。,四、实验内容,（五）营养缺陷型的检出 1分别制备酵母MM和CM两种平板，并打格编号。 2用无菌牙签将上述长出的再生菌落逐一在MM和CM两种 平板上依次在相应位置上点种，经培养后观察并检出营 养缺陷型。 3检出的缺陷型经再次验证、分离、直至获得纯种精确的 营养缺陷型。,四、实验内容,（六）营养缺陷型生长谱的确定。 1将缺陷型菌株接入CM液振荡培养、离心、洗涤菌体，制备成细胞悬 浮液。 2取细胞悬液lml，与20m1 MM琼脂培养基（融化并冷却至50）混合 后倾注平皿，即为缺陷型平板。 3

56、将15种可能的营养成分，配制成5组不同的营养组合混合液，用滤纸 圈片吸饱后，分别放于上述缺陷型平板的5个区间上，培养后根据其 生长情况，查表确定其营养要求。 4将确定的营养因子以合适浓度加入MM培养基中制成补充培养基(SM) 同时接种缺陷型菌株于MM和SM上进行缺陷营养因子的确证试验。 5将选育获得的营养缺陷型移接于 CM斜面上，培养后注明其遗传标 记，妥善保存备用。,大型综合实验二,酵母菌原生质体 融合育种,一、目的要求,1掌握原生质体融合育种的基本理论和基本过程； 2掌握酵母原生质体的制备、融合和再生的操作方法； 3，学习融合子的选择及实用性优良菌株的筛选思路和方法； 4培养和训练学生从事

57、微生物菌种选育的综合技能，提高学 生从事科学实验方案的设计与科学研究的素质。,二、基本原理,原生质体融合属于体细胞之间的无性融合，即用酶法将细胞膜外侧的细胞壁除掉，制备成无细胞壁的球状细胞体原生质体。将两种来源于微生物细胞A和B的原生质体，在融合诱导剂（或促进剂）聚乙二醇和Ca2+存在下等量混合起来，可使原生质体表面形成电极性，相互之间易于吸引、脱水粘合而形成聚集物，进而使原生质体收缩变形，紧密接触处的膜先形成原生质桥，逐渐增大而实现融合。融合的原生质体在适当的培养条件下可再生出细胞壁而形成一个新细胞，这个细胞有可能具有A.B两个原生质体原有的特性或更加优良的新的特性。 原生质体融合育种是基因重组育种的一种重要方法，可分为下列几个步骤： 1带遗传标记融合亲株的选择 2原生质体的制备 3原生质体的融合 4原生质体的再生 5融合子的选择与实用性菌株的筛选,三、实验材料,（一）菌株 1酵母菌A：耐高温酒精酵母（单倍体、营养缺陷型）； 2酵母菌B：高糖面包酵母（单倍体、营养缺陷型）； 3酵母菌C：耐高温酒精酵母（双倍体、不带标记、适于