细胞生物学实验.ppt

1、细胞生物学实验，实验一临时切片法3实验二细胞膜的透过性观察3实验三叶绿体的分离和观察3实验四线粒体的超活染色和观察3实验五植物组织培养技术6实验六移动根染色3实验七果蝇系列实验3，实验一，细胞多样性观察-临时切片法，【目的要求】1，熟练把握3种临时用【实验材料】、1、洋葱内皮细胞2、口腔上皮细胞3、人血细胞4、碘液： IKI5%乙醇调制。 5，0.85 %灭菌生理盐水6，普通显微镜，擦镜纸，载玻片，盖玻片，舌压板(消毒)，滴管及滴帽，沥青，二甲苯，消毒注射针，刀具，镊子，棉球。A Typical Animal Cell、A Typical Plant Cell、普通光学显微镜、显微镜的分辨率和

2、倍率，3 .分辨率：分解物体最小间隔的能力。 D=0.61/NA=0.61/sin/2其中是入射光线的波长。 NA是镜口率sin/2、n=介质折射率；=镜口角(样品相对于物镜镜口的张角) 。 思考：如何提高显微镜的分辨率？ 表1、一些介质的折射率、显微镜的一些光学特征、用于制作光学透镜的玻璃的折射率为1.651.78，使用的介质的折射率越接近玻璃越好。 sin /2的最大值必须小于1的介质是空气，以镜口率通常为0.050.95的油镜用沥青为介质，镜口率接近1.5。 普通光线的波长为400700nm，分辨率的数值不在0.2m以上，人眼的分辨率为0.2mm。 取下洋葱块茎，用刀具切割0.5 cm大

3、小的小块时，用镊子夹住内皮，轻轻剥离，放置在载玻片上，加入2滴碘液，510min后，盖上盖玻片，同时用吸水纸擦去过剩的碘液， 放置在显微镜下2 .将碘液滴加到2滴载玻片上，在口腔两侧(任意一侧)轻轻刮取口腔上皮细胞，在碘液上适当涂层，最后复盖玻璃罩。人血球涂层，3、一般从人耳垂或指尖取血。 采血的耳垂或指尖使用碘液和75%酒精消毒，用灭菌的刺血针刺入耳垂或指尖皮肤，流出血液，除去最初的水滴后取样。 血滴到灭菌载玻片的右面13处。 将另一张载玻片作为推板，使推板的一端与血滴接触，与血滴玻璃板形成350400的夹角。 血液沿着两片载玻片的接触线向两侧扩散后，保持夹住推片的角度，向血中玻璃的左侧迅速

4、前进，血液与推片一起前进，在血中玻璃上形成血膜，即血中膜。 血滴前按压时，根据滴下的血液量适时止住，盖上玻璃罩。4 .显微镜观察方法、将标本放置在载物台上-在低倍镜(10 )之前观察-高倍镜(40)-1cm抬起实验结束后，抬起镜筒-滴下二甲苯-将显微镜移动到原来的位置，放入镜箱，注意事项和作业停止再次按压的话，血膜会发生起伏，薄的厚度会变得不均匀。 按血膜时，如血滴大、角度大、速度慢、容易出现厚血膜，不利于观察。 2 .刮除口腔上皮细胞之前，要漱口，避免在镜子下观察残留的食物渣。 3 .油镜使用完毕后，必须立即用带有二甲苯的擦拭纸擦拭，以免油镜被污染。 【作业】1 .标绘观察到的几种细胞形态(

5、请标明倍率)，标明属于什么样的标绘法，实验2，细胞膜的透过性观察，【目的要求】1，了解细胞膜对物质透过性的一般规则。 2 .了解溶血现象及其发生机制。、Typical plasma Membrane、Erythrocyte Membrane Skeleton、电子显微镜下的红细胞、实验原理、细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择性渗透性屏障。 这是半透膜，可以有选择地控制物质进出细胞。 水是生物界最普遍的溶剂，水分子随着物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散的现象就是渗透。 将红细胞放入低渗透盐溶液中，水分子大量渗透到细胞内的话，细胞膨胀破坏，血红蛋白释放到介质中，从不透明的

6、红细胞悬浊液变成红色透明的血红蛋白溶液的现象被称为溶血。 扩散和渗透、水的渗透也同样从自由能高的地方向自由能低的地方移动，考虑到溶质的浓度，水从溶质浓度低的地方向溶质浓度高的地方流动。 红细胞膨胀和收缩，将红细胞放入某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各溶质的渗透性不同，膜两侧的渗透压平衡发生变化，也会引起溶血现象。 因此，溶血现象发生所需要的时间长度可以作为测定物质进入红细胞的速度的一个指标。 本实验使用红细胞作为细胞膜透过性的实验材料，将其放入不同的电介质溶液中，观察红细胞的变化。 限制因子、脂溶性细胞质膜通透性有选择性。 Size :质膜的透过性孔径在0.5-1.0nm以下，能够扩散的最小分

7、子是水分子。 极性物质通常与水结合形成水合壳，不仅增加分子体积，而且大幅降低脂溶性。 脂溶性的、分子量小的、非极性物质容易通过细胞膜的实验用品，1、材料：普通显微镜、普通离心机、扭矩天平、10ml试管、第10ml离心管、试管架、2ml注射器(不需要注射针)或5ml移液管、洗涤2 .试剂： 0.128mol/L NaCl溶液L NH4Cl溶液、0.128mol/L NH4AC溶液、0.128mol/L NaNO3溶液、0.09mol/lnaal 3、材料：鸡血球。 操作方法： 1、取鸡血lml，用O.128molL的NaCl溶液9ml洗涤3次(每次洗涤需要1000 rmin离心5min )，最后

8、配制30%的红细胞悬浮液。 取2.11根试管，按照附表所示的试验溶液，分别取样3ml，做标记后，在各管中加入2滴红细胞悬浮液，混合后静置在温室中，观察各试管发生溶血的时间及其变化。 【观察结果】、1、试管内的液体分为两层：上层为淡黄色透明，下层为红色不透明不溶血()，镜检红细胞完全呈双凹盘状。 2 .试管内液体混浊、上层带红色者称不完全溶血(或)，镜检部分红血球呈碎片。 3 .试管内液体变红透明者称为完全溶血()，经镜检可知细胞均呈碎片。 【注意事项】1、鸡血在离心分离时，试管必须在扭矩天平上平衡。 2 .离心结束后，仔细倾斜上层血浆及中层血小板等成分，尽量使其干燥。 将红细胞的体积放入目视或

9、带刻度的离心管中，加入生理盐水使之成为30%的红细胞悬浊液3 .如果试管中有红细胞和检验溶液，请不要人为地摇晃，以免红细胞破裂。 【作业】1 .写实验报告，就细胞膜对不同物质的渗透性差异，分析实验结果(参照表1 )。 表1各种溶液的溶血现象观察结果、目视法判定基准：急速溶血； 慢溶血：或不溶血：观察各种溶液溶血现象，实验三，叶绿体的分离与观察，【实验目的】1，通过分离植物细胞叶绿体，了解细胞器分离的一般原理和方法。 2、观察叶绿体及气孔、表皮细胞，保护细胞形态，加深植物组织形态的理解，叶绿体，【实验原理】使动植物组织均匀悬浮在等渗透介质中，进行差速离心是分离细胞的常用方法。一个粒子在离心场中的

10、沉降速度取决于粒子的大小、形状稠密度，也与离心力及悬浮介质的粘度有关。 在某个离心场，同一时间内密度和大小不同的粒子沉降速度不同。 通过依次增加离心力和离心时间，可以使不均匀悬浮液中的粒子以其大小、密度分批沉降到离心管底部，并进行回收，从而得到各种亚细胞成分。 叶绿体的分离在等渗透溶液(0.35 mol/L氯化钠或0.4 mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的变化损伤叶绿体。 将均匀浆液在1000 rmin的条件下离心2分钟，除去其中的组织残渣和最终破碎完整的细胞。 之后，在3000 rmin的条件下离心5分钟，可以得到沉淀的叶绿体(细胞核的一部分混合存在)。 如果分离过程最好在05的条件下

11、进行，则必须迅速分离观察。 【实验材料】、1、主要设备：普通离心机、组织捣固机、扭矩天平、光学显微镜。 2、小型器材： 500m1烧杯2个，250m1量筒1个，吸管10根，10m1目盛远心管20根，纱布若干，载玻片和盖片各4枚。 3，0.35摩尔/升NaCl溶液。 4、新鲜菠菜。 【操作方法】，a，游离叶绿体的制备和观察1，选择新鲜的菠萝叶清洗擦拭后，去除叶梗和群脉，将30g放入150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，放入组织印花机。 2 .利用组织碎石机低速(5000 rmin )匀浆35mm。 3 .用200目尼龙网或6层纱布过滤匀浆，放入500m1烧杯中。 4 .取滤液4m1，以

12、1000 rmin离心2min。 扔掉沉淀物。 5 .以3000 rmin离心上清液5min。 丢掉上清液后，沉淀成为叶绿体(细胞核的一部分混合)。 6 .用0.35molL NaC1溶液悬浮沉淀物。 7 .取出叶绿体悬浊液，在载片上滴下1滴，按下载片，可在通常的光学镜下观察。 b、组织中叶绿体观察取适量新鲜菠菜嫩叶，放入乳钵中，加入少量0.35mol/L NaCl溶液粉碎，取上层浸出液，镜下观察叶肉细胞结构中叶绿体和细胞保护等形态。 【观察结果】1 .在普通的光学镜下，叶绿体可见绿色的橄榄形，在高倍镜下，叶绿体内部可见深绿色的小粒子，即含有基粒。 2、表皮细胞呈鳞片状或不规则形状，常与气孔相

13、连，无色。 3 .叶肉细胞呈长方形或类方形，内多含有带绿色的叶绿体粒子细胞，后者可呈单一或多个序列。 另外，还发现在视野下分散着很多点状或类圆状的叶绿体粒子。 4 .叶脉导管呈螺纹状。 5 .保护细胞呈肾状，两者构成一个气孔。 6 .气孔有时呈纺锤形、圆形(开放时)，有时呈带状(封闭时)。 【作业】1、描绘分离的细胞成分(明确记载形态的倍率)。 2 .分离细胞成分时，为什么添加氯化钠0.35mol/L，实验4，线粒体的超活性染色和观察，【实验目的】1，观察动、植物生细胞内线粒体的形态、数量和分布。 2 .学习一些细胞器的超活染色技术。 线粒体，【实验原理】生物染色是一种能着色生活有机体的细胞和

14、组织的某种结构，但不影响细胞的生命活动，发生任何理化变化引起细胞死亡的染色方法。 因此，生染技术通常可以用于研究生活状态下细胞的形态结构和生理、病理状态。 体内的生染以胶体状染料溶液运动，注入植物体内，染料胶体颗粒固定、沉积在细胞内的某些特殊结构上，达到容易识别的目的。 体外活性染色也称为超活性染色，它从植物中分离出一部分细胞或组织的小块，用染料溶液浸染，染料有选择地固定在活细胞的某些结构上显色。Janus green B、詹纳斯绿b是毒性小的碱性染料，能够特异性地对线粒体进行超活性染色。 这是因为在线校体内细胞色素氧化酶系的作用下，染料总是保持氧化状态(即有色状态)，呈现蓝绿色。 在线粒体周

15、边的细胞质中，这些染料还原为无色的色基(无色状态)。 【实验材料】、1、器材：显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、表面盘、吸管、牙签、吸水纸。 Ringer溶液将氯化钠0.85g氯化钾0.03g蒸馏水100ml 3、1%詹纳斯绿b溶液(原液) 50mg溶解在5ml Ringer中，加入少许低烧(3040 )使其溶解，用滤纸过滤后4 .詹纳斯绿b溶液(应用液现役分红。 5 .肝细胞、人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞。 (1)人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察1，取清洁载玻片放置在37恒温水槽的金属板上，滴加2滴詹纳斯绿b应用染液。 2 .被验者用牙签将上皮细胞用力刮去到自己的口腔颊粘膜上，将

16、刮去的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色1015min (注意不要使染液干燥，必要时可以加染液)，盖上盖玻片，用吸水纸吸取充满周围的染液3 .在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。 可知扁平状上皮细胞的核周围细胞质中分布着被染色或青绿色的颗粒状或短棒状的结构，即线粒体。 (二)大鼠肝细胞线粒体超活染色观察：脊椎脱位法处死大鼠，放入解剖盘，切腹腔，取大鼠肝缘薄肝组织块，放入表面盘。 用吸管吸取Ringer液，反复浸泡清洗肝脏，冲洗血液。 2 .如果在干净的凹面载玻片口袋中滴入二那格林b应用液，将肝组织块移入染液中，注意不要完全淹没组织块，使组织块的上部露出染液的一半，则细胞内的线粒体面系统被充分氧化，容易被染色。 组织块的边缘染成蓝绿色(一般染成2030min )。 3 .吸引染液，滴入Ringer溶液，用眼科切割将组织块的着色部分切除，使细胞或细胞群散开。 之后，用吸管吸取分离出的细胞悬浊液，一滴一滴地滴在载玻片上，盖上玻璃罩进行观察。 在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，在具有l2核的肝细胞质中，发现很多染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布情况。 (三)洋葱鳞茎表反细胞线粒仲的超活染色观察，1、用吸引管吸引詹纳斯绿b应用染液，在干净的承载碎片上逐滴滴加，撕裂洋葱茎内表