《生化反应工程实验》PPT课件.ppt

1、芽孢杆菌发酵动力学及碱性磷酸水解酶促反应动力学研究，实验目的，1。掌握细胞反应动力学的研究方法；将还原糖和生物质的测定原理和方法结合起来。掌握酶促反应速度的实验决定。4.掌握最大反应速度rmax和米氏常数Km的测量方法。第二个实验原理，对细胞的反应：实验可以获得不同T的基质浓度Cs值和Cx值(细胞浓度)。动力学参数KS，max需要。必须求出，测定时间区间T内细胞浓度平均值。碱性磷酸水解酶碱性条件下磷酸单酯水解催化剂。酶催化反应机理：可以推导出米氏方程：通过在不同基质浓度CS中测定反应速度R，可以确定rmax和Km。在510nm波长上非颜色地测量ODM值，以计算酶的活性(反应速度R)。Na2HP

2、O4，H2O，碱性磷酸水解酶，特定pH，T，催化反应：醌化合物(红色)，AAP，铁氰化钾，OH，3种，培养基，实验试剂和主要仪器，杆菌亚基(NH4)2so 41%；KCl 0.1%；CaCl 20.1 mmol/l；MgCl 21m mol/l:Na2 hpo 420mol/l；0.1%的酪蛋白水解溶于0.1mol/LTris-HCl缓冲区(pH7.4)。150ml三角瓶，每瓶50ml，115，灭菌30min，冷却。(星期二下午)30.1mol/LTris-HCl缓冲(pH7.4)40.1mol/L pH8.8Tris-乙酸缓冲540mmol/L底物溶液60.5mol/L氢氧化钠溶液70.3%

3、 5 DNS试剂甲苯12吸管，刻度管，容量瓶，滤纸，三角瓶，布漏斗，电子秤，恒温水浴，摇床，干燥，721分光光度计4茄子试验方法和程序，1。种子液制备(半单位)枯草杆菌在固体斜培养基中激活后。连接8个装有50ml Tris-培养基的150ml三角瓶，在30振动下用种子液培养18h。(星期三下午2336030)，2。发酵液制备(组)包括上述培养的种子液50ml tris10个装有培养基的150ml三角瓶，接种量5 (V: V)，37振动中0h，1h，表1发酵动力学实验数据，3枯草杆菌碱性磷酸酶的制备，2瓶种子液，酶促反应动力学研究，反应前：反应后：酶活性(单位)=OD5101000=(OD510

4、反应后OD510反应前)1000，r是酶活性。气质浓度对酶促反应速度的影响rmax和Km的测定，13个试管，编号，根据下表正确操作。用空管零，510nm波长比色测定A510nm。5实验结果，1 .发酵动力学确定，发酵实验数据处理，制作，确认max和Ks。决定发酵动力学。2 .气质浓度对酶促反应速度的影响rmax和Km的测量，酶促反应实验数据处理，在坐标纸上制作1/r1/CS图，得出Km和rmax值。3，5二硝基水杨酸比色法(DNS方法)在还原糖、附录1，1，1原理、一定范围内，还原糖的数量与褐色红色物质颜色的深浅成正比，在540nm波长上测定光密度值，可以通过调查标准曲线得出还原糖的数量。2试

5、剂，1。3，5二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)2。1mg/ml葡萄糖标准液体，7个25ml刻度试管，编号，下表操作。2 .建立标准曲线，将上述各宽容液均匀混合后，在540nm波长下用空宽容液调节0，以测量吸光度值。以光密度值为横坐标，以葡萄糖毫克数为纵坐标绘制标准曲线。以10个试管为例，按表格操作。均匀混合各管后，测定各管的光密度。用制作标准曲线的空管溶液调节0。，3 .糖的测定，每杯浓度(mg/ml)=每还原毫克数/0.3，在标准曲线中阐明相应的还原糖含量，并根据下面的公式计算发酵液每杯浓度。菌体(CX)测量：附录2，生物量测量方法有浊度法和直接计量法等。本实验两组采用浊度法，两组直接采用计量

6、法。比浊法是根据菌显液的透光量间接测定细菌数。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与光密度成正比，因此可以用色度计测定菌液的光密度(OD值)，表示样品菌液浓度。具体操作：将培养0 h，1h，2h，2.5h，3h，3.5h，4h，4.5 h，5h，5.5 h的菌悬浮液均匀摇晃，以560nm波长的0D值测定为CX。使用未接种的培养基作为空对照组。1 .浊度法、牙齿法分为湿重法和干重法。干重法系单位体积培养物经过滤(或离心)后，在105烤箱中烘干至恒重(11.5hr)，冷却至室温，称重。具体操作：首先将干燥的滤纸重量放在W1(g)、发酵液过滤、上清液保存在冰箱里进行糖浓度测定，从菌体和滤纸105烤到恒重，然后叫滤纸及菌体重量，用W2(g)标记，按下式计算菌体生