现代分子生物学第二章.ppt

1、第二章 染色体与DNA,染色体 DNA的结构 DNA的复制 DNA的修复 DNA的转座,一、染色体（Chromosome),内容提要： 细胞周期 染色体与染色质 染色体的结构和组成（原核生物、真核生物） 核小体 原核生物和真核生物基因组结构特点比较,（一）细胞周期,（二）染色体与染色质,染色体（chromosome）是细胞在有丝分裂时遗传物质存在的特定形式。 真核生物的染色体在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色质(chromatin)的形式存在的。 染色质是一种纤维状结构，叫做染色质丝，它是由最基本的单位核小体(nucleosome)成串排列而成的。,（三）染色体的结构和组成,原核生物(pr

2、okaryote),染色体简单： DNA和非组蛋白组成 基因序列和蛋白质序列线性对应 遗传信息含量少： 只有一条染色体 单拷贝基因,真核生物染色体的组成,组蛋白的一般特性： 1、进化上的极端保守性 保守程度：H1 H2A、H2B H3 、H4 对稳定真核生物染色体结构的重要性,蛋白质,上海生化所分子遗传学1998年试题： 在真核生物核内，五种组蛋白（H1 H2A H2B H3 和H4）在进化过程中，H4极为保守，H2A最不保守（ ）,组蛋白的一般特性：,2、无组织特异性 红细胞染色体不含H1,而是H5。精细胞的组蛋白是鱼精蛋白。 3、肽链氨基酸分布的不对称性 碱性氨基酸分布在N端，疏水氨基酸分

3、布在C端。 4、H5组蛋白的特殊性：富含赖氨酸（24%） 5、组蛋白的可修饰性,在细胞周期特定时间可发生甲基化、乙酰化、磷酸化和ADP核糖基化等。H3、H4修饰作用较普遍，H2B有乙酰化作用、H1有磷酸化作用。,所有这些修饰作用都有一个共同的特点，即降低组蛋白所携带的正电荷。这些组蛋白修饰的意义：一是改变染色体的结构，直接影响转录活性；二是核小体表面发生改变，使其他调控蛋白易于和染色质相互接触，从而间接影响转录活性。,组蛋白的可修饰性,1) DNA的变性和复性 变性（Denaturation) DNA双链的氢键断裂，最后完全变成单链的过程称为变性。 增色效应(Hyperchromatic ef

4、fect) 在变性过程中，260nm紫外线吸收值先缓慢上升，当达到某一温度时骤然上升，称为增色效应。 融解温度（Melting temperature,Tm ) 变性过程紫外线吸收值增加的中点称为融解温度。生理条件下为85-95。影响因素：G+C含量，pH值，离子强度，尿素等,真核生物的DNA,复性（Renaturation) 热变性的DNA缓慢冷却，单链恢复成双链。 减色效应（Hypochromatic effect) 随着DNA的复性， 260nm紫外线吸收值降低的现象。,2) C值反常现象（C-value paradox)/ C值矛盾 C值：一种生物的单倍体基因组DNA的总量。 C值反常

5、：真核生物中，C值一般是随着生物进化而增加的，高等生物的C值一般大于低等生物，但是某些较低等的生物C值却很大，如一些两栖动物的C值甚至比哺乳动物还大，并且在两牺动物中C值的变化也很大，可相差100倍。这就是著名的“C值反常现象”。,不重复序列/单一序列：在基因组中有一个或几个拷贝。真核生物的结构基因在单倍体中都是单拷贝的。如：蛋清蛋白、血红蛋白等。功能：主要是编码蛋白质。 中度重复序列：在基因组中的拷贝数为101104。如：rRNA、tRNA。一般是不编码蛋白质的序列，在调控基因表达中起重要作用。 高度重复序列：拷贝数达到几百个到几百万个。卫星DNA：AT含量很高的简单高度重复序列。,根据 D

6、NA复性动力学研究，DNA序列可以分成哪几种类型？并加以举例说明。(2001年上海生化所）,（四）核小体(nucleosome),Nucleosome、chromosome、genome 中科院2002年硕士学位研究生入学分子遗传学试题,1、定义：用于包装染色质的结构单位，是由DNA链缠绕一个组蛋白核构成的。 2、实验证据： 1）染色质DNA的Tm值高于自由DNA。 2)DNA酶对染色质的消化低于纯DNA, 消化后DNA片段的大小为200bp的整数倍。,串珠状核小体结构,真核生物染色质的基本单位是核小体。 组成串珠状结构。,核小体的组成 DNA：约146bp 组蛋白核心： H2A，H2B H3

7、 H4 连接处：H1,2、核小体的结构,核小体的形成,6.8:1,40:1,1600:1,8000:1,DNA double helix,Nucleosome (10 nm fiber),30 nm Fiber,Loops I,Loops II,chromosome,3、染色体的包装超螺旋结构,串珠状核小体,DNA双螺旋片段,染色质纤维 30nm纤维,伸展形染色质片段 环,密集形染色质片段 玫瑰花瓣,整个染色体, 基因组很小，大多只有一条染色体，DNA含量少； 结构简炼：只有非常少的一部分不转录，不同于真核DNA的冗余；,1、原核生物基因组结构特点,（五）原核生物和真核生物基因组结构特点比较,

8、存在转录单元、多顺反子(polycistron),X174 D-E-J-F-G-H mRNA 蛋白J、F、G H D E,E.coli 色氨酸操纵子 9个顺反子 9个酶 。,原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因，往往丛集在基因组的一个或几个特定部位，形成转录单元。它们可被一起转录为含有多个mRNA的分子，成为多顺反子mRNA。, 有重叠基因（Sanger 发现） 基因内基因 部分重叠基因 一个碱基重叠,2、真核生物基因组结构特点,真核基因组结构庞大 3109bp、染色质、核膜 非编码区较多 多于编码序列(9:1),和原核生物最重要的区别 含有大量重复序列 单顺反子 基因不连续性 断

9、裂基因(interrupted gene)、内含子(intron)、外显子(exon) 存在大量的顺式作用元件，包括启动子、增强子。 存在大量的DNA多态性，即DNA序列中发生变异而导致的个体间核苷酸序列的差异，包括单核苷酸多态性和串联重复序列多态性两类。 具有端粒结构,端粒是染色体末端的DNA重复序列。 功能： 稳定染色体末端结构，防止染色体间末端连接。 组织培养的细胞证明，端粒在决定动植物细胞的寿命中起着重要作用，经过多代培养的老化细胞端粒变短，染色体也变得不稳定。,端粒,第二章 染色体与DNA,染色体 DNA的结构 DNA的复制 DNA的修复 DNA的转座,二、DNA的结构,1） 概念

10、指4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序， DNA序列是这一概念的简称。碱基序列,1、 DNA的一级结构,核苷酸之间以3 , 5 -磷酸二酯键连接形成多核苷酸链，即核酸。 核酸具有方向性：一端有游离的磷酸基，一端有游离羟基。,C,G,A,书写方法,2）特征： 双链反向平行配对而成 脱氧核糖和磷酸交替连接，构成DNA骨架，碱基排在内侧 内侧碱基通过氢键互补形成碱基对（A：T，C：G）。,2、DNA的二级结构,1）定义：指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产生的双螺旋结构。,2）DNA双螺旋结构模型要点,1. 两条链反向平行，围绕同一中心轴构成右手双螺旋 (double helix)。表面有大沟和小沟。 2.

11、 磷酸-脱氧核糖骨架位于螺旋外侧骨架，碱基垂直于螺旋轴而伸入内侧。 3. 螺旋直径2nm，每圈螺旋含10个碱基对 (bp)，螺距为3.4nm。,碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行,3）分类： 右手螺旋：A-DNA，B-DNA 左手螺旋：Z-DNA,A,B,Z,在相对湿度75%条件下制得的DNA钠盐纤维的X射线衍射分析表明，其分子结构与B-DNA不同： 反向平行的双链DNA分子右手螺旋结构 每螺周含11个核苷酸残基，螺距2.46nm，直径2.6nm DNA-RNA形成的杂交双链为A型双螺旋,A-DNA,人工合成的寡聚脱氧核苷酸(dCGCGCG): 两条反向平行的寡聚脱氧核苷酸链以左手螺旋盘绕

12、； 每螺周含12个脱氧核苷酸残基； 螺距3.8nm；分子主链走向呈锯齿状，称Z-DNA,Z-DNA,A,B,Z,3、DNA的高级结构,1）定义：指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。是一种比双螺旋更高层次的空间构象。 2）主要形式：超螺旋结构（正超螺旋和负超螺旋）,线状DNA形成的超螺旋,环状DNA形成的超螺旋,拓扑异构酶 or溴化乙锭,拓扑异构酶 or溴化乙锭,DNA扭曲与双螺 旋相同（拧紧）,DNA扭曲与双螺旋相反（松开）,负超螺旋,松弛DNA,正超螺旋,意义：DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。,当DNA分子在溶液中以一定

13、的构象存在时，双螺旋处于能量最低的状态，此为松弛态；如果这种正常的DNA分子额外地多转几圈或少转几圈，就会使双螺旋中存在张力。当DNA分子的两端是固定的，或是环状分子，则这种额外的张力就不能释放掉，DNA分子就会发生扭曲，用以抵消张力。这种扭曲称为超螺旋，即双螺旋的螺旋。 在生物体内，绝大多数的DNA是以超螺旋的形成存在的。,超螺旋,连环数(linking number,L): 是指共价闭合的DNA分子的两条链相互缠绕的次数。只要DNA双螺旋保持完整，其值不会变。对于闭合环状DNA，其值也是整数。 缠绕数(twist,T): 指螺旋的轮(圈)数。 超螺旋数(writhing number,W)

14、：指DNA双螺旋绕超螺旋轴的次数。DNA拓扑学上的关系可用下面的式子表示: L = T + W T和W可以不是整数。,DNA的拓扑学性质,一定环状DNA分子因拓扑学性质的不同而产生的不同形式, 称为拓扑异构体(topoisomers)。,第二章 染色体与DNA,染色体 DNA的结构 DNA的复制 DNA的修复 DNA的转座,三、DNA的复制,内容提要： DNA的半保留复制 与DNA复制有关的物质 DNA的复制过程（大肠杆菌为例） DNA复制的其它方式 真核生物中DNA的复制特点,1、定义：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种

15、复制方式称半保留复制。,（一）DNA的半保留复制（semi-conservative replication）,中国科学院上海生化与细胞所2002年招收硕士研究生分子遗传学入学考试： 请设计一个实验来证明DNA复制是以半保留方式进行的（8分）。,2、实验证据（1958 Meselson和Stahl）：,Matthew Messelson Franklin Stahl,3、DNA半保留复制的生物学意义：,DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。,（二）与DNA复制有关的物质,1、原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、 dCTP、dTTP) 2、模

16、板：以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA 3、引物：DNA的合成需要一段RNA链作为引物 4、引物合成酶（引发酶）：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。,5、 DNA聚合酶:以DNA为模板的DNA合成酶 以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物 反应需要有模板的指导 反应需要有3-OH存在 DNA链的合成方向为5 3 ,主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。,修复紫外光引起的DNA损伤,DNA复制的主要聚合酶，还具有3-5外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性,原核生物中的DNA

17、聚合酶(大肠杆菌）, 定位 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核 3-5 外切 - - + + + 5-3 外切 - - - - - 功能,引物 合成,修复 作用,线粒体DNA 的复制,核DNA 的复制,？,真核生物中的DNA聚合酶,6、DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。 但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来 DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用,7、DNA拓扑异构酶(DNA Topisomerase)：,拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松

18、解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。例：大肠杆菌中的蛋白 拓扑异构酶：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。 例：大肠杆菌中的DNA旋转酶,8、DNA 解螺旋酶 /解链酶（DNA helicase),通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。 E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。 rep蛋白沿35移动，而解螺旋酶I、II、III沿53移动。,9、单链结合蛋白(SSBP-single-strand binding protein)：稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。,（三）DNA的复

19、制过程（大肠杆菌为例）,双链的解开 RNA引物的合成 DNA链的延伸 切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段,1、双链的解开,DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。ori、富含A、T的区段。,基本概念：,从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子。,复制时，解链酶等先将DNA的一段双链解开，形成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故称为复制叉。,复制方向和速度：,单起点、双向等速,多起点、双向等速,双链解开、复制起始,大约20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合,在DNA结合蛋白HU蛋白和ATP的共同作用下，DNA复制起始复合物使3个13bp直接

20、重复序列变性，形成开链。,解链酶六体分别与单链DNA相结合(需DnaC帮助)，进一步解开DNA双链,起始复合体由DnaA、DnaB(解螺旋酶)、DnaC、引物酶、拓扑异构酶、HU（类组蛋白）、单链结合蛋白（SSB）和RNA聚合酶组成。,2、RNA引物的合成,DnaB蛋白活化引物合成酶，引发RNA引物的合成。 引物长度约为几个至10个核苷酸，,基因组DNA复制时，先导链的引物是DNA，后随链的引物是RNA 2002年上海生化与细胞所,DNA的半不连续复制（semi-discontinuous replication),DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不

21、连续复制。,在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链为滞后链。,3、DNA链的延伸,在DNA复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成53 的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。,Leading strand,Lagging strand,Replication fork,华中科技大学2004年生物化学与分子生物学硕士研究生入学试题 名词解释：冈崎片段（3分） 选择：原核DNA合成酶中（ ）的主要功能是合成前导链和冈崎片段 A、DNA聚合酶 B、DNA聚合酶 C、

22、DNA聚合酶 D、引物酶,武汉大学2003年硕士研究生入学分子生物学试题： Replicon、 semi-conservative replication,4、切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段 （复制终止）,在DNA聚合酶催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链,双链环状、型复制、双向等速,（四）DNA复制的其它方式,滚环型： 单向复制的特殊方式，如：174的双链环状DNA复制型（RF） （1）模板链和新合成的链分开； （2）不需RNA引物，在正链3-OH上延伸； （3）只有一个复制叉,（五）真核生物中DNA

23、的复制特点,1、真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子 2、真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始DNA复制；而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始新的复制(多复制叉)。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。 3、真核生物有多种DNA聚合酶。,第二章 染色体与DNA,染色体 DNA的结构 DNA的复制 DNA的修复 DNA的转座,四、DNA的修复,1、错配修复,Dam甲基化酶使母链位于5GATC序列中腺甘酸甲基化 甲基化紧随在DNA复制之前进行 根据复制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子链上的错配碱基,根据母链甲基化原则找出错配碱基的示意图,发现错配碱

24、基,在水解ATP的作用下，MutS、MutL与碱基错配点的DNA双链结合,MutS-MutL在DNA双链上移动，发现甲基化DNA后由MutH切开非甲基化的子链,甲基化指导的错配修复示意图,错配碱基位于切口3下游端,错配碱基位于切口5上游端,5,3,2、碱基切除修复,一些碱基在自发或悠变下会发生脱酰胺，然后改变配对性质，造成氨基转换突变 腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对 鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对 胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对,胞嘧啶去氨基生成尿嘧啶,如果复制发生就会产生一个突变,糖苷水解酶识别改变了的碱基，把碱基从N-糖苷键处切下来，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点。,由AP

25、磷酸内切酶将受损核苷酸的糖苷-磷酸键切开,OH,DNA连接酶连接,利用DNA聚合酶I切除损伤部位，补上核苷酸,3、核苷酸切除修复,1）核苷酸发生损伤，导致双链间无法形成氢键 2）通过特异的核酸内切酶识别损伤部位 3）由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸 4）DNA 聚合酶以母链为模板复制合成新子链 5）DNA连接酶将切口补平,识别损伤部位,损伤的两边切除几个核苷酸,DNA 聚合酶以母链为模板复制合成新子链,DNA连接酶将切口补平,4 、DNA的直接修复,在DNA光解酶的作用下将环丁烷胸腺嘧啶二体和6-4光化物还原成为单体,甲基转移酶使O6-甲基鸟嘌呤脱甲基生成鸟嘌呤，防止G-T配对,第二章

26、染色体与DNA,染色体 DNA的结构 DNA的复制 DNA的修复 DNA的转座,五、 DNA的转座,（一）基本概念：,DNA的转座：由可移位因子介导的遗传物质重排现象。在转座的过程中，可移位因子的一个拷贝常留在原来的位子，在新位子出现的仅仅是它的拷贝。,转座子（transposon）：存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。,（二）转座子的类型和结构特征,原核生物转座子的类型：,1、插入序列(insertional sequence,IS),2、复合转座子(composite transposon),3、TnA家族,1、插入序列(IS),IS是最简单的转座子，不含有任何宿主基因，它们是

27、细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。 转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。用标准命名法对这些突变进行编号：如:IS1表示一个IS1序列插入到噬菌体基因组。 IS序列是可以独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白，也可作为其它转座子的组成部分。,Figure Transposons have inverted terminal repeats and generate direct repeats of flanking DNA at the target site. In this example, the target is a 5 bp sequence. The ends o

28、f the transposon consist of inverted repeats of 9 bp, where the numbers 1 through 9 indicate a sequence of base pairs.,复合转座子是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。 复合转座子中的IS序列不能单独移动只作为复合体移动。,2、复合转座子(composite transposon),A composite transposon has a central regio

29、n carrying markers (such as drug resistance) flanked by IS modules. The modules have short inverted terminal repeats. If the modules themselves are in inverted orientation (as drawn), the short inverted terminal repeats at the ends of the transposon are identical.,复合转座子具有IS组件,(三）转座作用的机制,复制性转座子,非复制性转座子,上海生化所1998年分子遗传学试题： 转座过程通常是指DNA中的一段特殊序列（转座元）在转座酶以及其它蛋白因子的作用下，从DNA分子中的一个位置被搬移到另一位置或另一DNA分子中（ ） Tn10转座到一个新的DNA靶点时，在靶点两侧形成倒转重复序列。 (),中国科学院遗传与发育生物学研究所1996年硕士研究生分子遗传学入学试题 转座子（transposon） 反转录转座子（retrotransposon）,反