基因工程的基本操作程序 (2).ppt

1、1.2 基因工程的基本操作程序,课标要求:,1简述基因工程的原理和基本步骤 2简述基因工程基本操作程序的四个步骤 （前两个步骤） 重点：基因工程基本操作程序的四个步骤（前两个步骤） 难点：（1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因 (3)原核生物与真核生物基因结构的异同,四个主要步骤:,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,知识点一.基因工程基本操作的四个步骤,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,使目的基因在

2、受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用,载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,知识点一.基因工程基本操作的四个步骤,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用,载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。,一、目的基因的获取,(一)、目的

3、基因主要是_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,补充知识:,1、原核生物的基因结构,2、真核生物的基因结构,请阅读P9第一和二两段,知识点二：1.原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落),不能转录为信使RNA，

4、不能 编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,知识点二：2.真核细胞的基因结构,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序

5、列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点等。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,一、目的基因的获取,(二)、目的基因的来源:,1、从自然界已有的物种分离 2、人工方法合成,（三）、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,请阅读P9第一和二两段,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,1.基因文库：概念见P9,2.基因文库的分类:,种类,基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：

6、只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库,3.基因文库的目的,为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。,4.获取目的基因的根据：,见课本P9,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,5.基因文库的构建方法之一,（1）直接分离法,某种生物的单链mRNA,单链互补DNA,双链cDNA片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,反转录法：cDNA的合成流程图解,5.基因文库的构建方法之,基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较,2、利用PCR技术扩增目的基因

7、,四种脱氧核苷酸(dNTP),一对引物：,热稳定DNA聚合酶(Taq酶）,模板DNA( 需含有目的基因 ),Mg2+(激活剂),条件：,缓冲溶液,与目的基因的起始段互补,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物,前提：,过程,变性（高温使双链DNA解旋为单链）,复性(退火)（引物与单链互补结合）,延伸（在Taq酶的作用下合成 与模板互补的DNA双链）,重复循环,2、具体过程, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、 _、_ 、 _.等,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复

8、制,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA

9、片段,形成整个DNA分子,目的基因的mRNA,单链DNA (cDNA）,双链DNA (即目的基因),反转录,合成,1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,3、人工合成的目的基因,二、基因表达载体的构建 基因工程的核心,1、目的： 所需物质：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,它们各自的作用是什么?,2、基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,它们各自的作用是什么?,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录 标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接