人类细胞质RNA提取、RT-PCR的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 (2).ppt

1、2020年8月7日，核糖核酸，2020年8月7日，逆转录聚合酶链反应从人细胞质中提取核糖核酸的原理和方法，琼脂糖凝胶电泳结果的分析和应用，主要内容，从人细胞质中提取核糖核酸，2020年8月7日。真核细胞的总RNA主要由rRNA(80-85%)、tRNA和小RNA(10-15%)以及mRNA(1-5%)组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。大多数真核细胞的基因在它的3个末端有一个聚腺苷酸尾。2020/8/7、实验前的准备、核糖核酸实验失败的主要原因是核糖核酸酶的污染。Rnase是广泛和稳定的，可以承受各种处理而不失活，如煮沸和高压灭菌。只要有少量的核糖核酸酶存在，就会引起核糖核酸的

2、降解，制备的核糖核酸的纯度和完整性会直接影响核糖核酸分析的结果。因此，建立一个没有核糖核酸酶的环境来制备核糖核酸是非常重要的。2020/8/7，常用RNase抑制剂，1。焦磷酸二乙酯(DEPC):与组氨酸的咪唑环结合，组氨酸是核糖核酸酶的活性基团，从而使核糖核酸酶失活并引起高度致癌性。(用于实验准备阶段)2。异硫氰酸胍和氯仿：提取核糖核酸并灭活核糖核酸酶。3.RNase蛋白抑制剂(RNase):从大鼠肝脏或人胎盘中提取的酸性糖蛋白。(用于cDNA合成阶段)，2020/8/7，实验原理，Trizol试剂盒是苯酚和异硫氰酸胍(GTC)的混合物，它可以裂解细胞，促进核糖体的解离，并从蛋白质中分离出核

3、糖核酸。酸性苯酚可以通过加入氯仿提取，酸性苯酚促进核糖核酸进入水相。离心后，核糖核酸保留在水相中，而脱氧核糖核酸和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀核糖核酸，得到纯化的总核糖核酸。2020/8/7、RNA提取、(1)试剂的制备、氯仿、异丙醇、75%乙醇、无核糖核酸酶的水或0.5SDS(所有溶液必须用DEPC处理过的水制备)、2020/8/7、RNA提取、(2)操作步骤，用生理盐水冲洗：个样品后，用15毫升离心管(4000转/分钟，5分钟)收集细胞，弃去上清液，向沉淀物中加入1毫升TRIzol，涡旋10秒，再悬浮沉淀物在1530下放置5分钟后，加入0.2毫升氯仿，用手摇动15秒，在1

4、530下放置5分钟，并以12000转/分钟离心15分钟。 2020/8/7、RNA提取，(2)操作步骤，小心吸取上清液，将其转移到新的1.5毫升Ep管中，加入等体积的异丙醇，在1530下放置10分钟，以12000转/分钟离心10分钟15分钟，小心去除上清液，加入1毫升70%乙醇，振荡几秒钟，以8000转/分钟离心5分钟，小心去除上清液并在室温下干燥加入10微升DEPC水，在55个水浴中均匀搅拌10分钟，(3)注意事项：1 .塑料器皿可以在0.1摄氏度的水中浸泡12小时以上，并在高压下灭菌。2.有机玻璃电泳槽可用洗涤剂清洗，用双蒸水冲洗，用乙醇干燥，在室温下用3%H2O2浸泡10分钟，然后用0.

5、1的水冲洗并干燥。3.所有玻璃器皿在使用前应在180下烘干6小时或更长时间。4.制备的溶液应尽可能在37下用0.1% DEPC处理12小时以上。然后高压灭菌除去残留的DEPC。不能用高压灭菌法灭菌的试剂应使用经DEPC处理的无菌双蒸水制备，然后用过滤膜灭菌。5.操作人员佩戴一次性口罩、帽子和手套，实验过程中应经常更换手套。2020/8/7，核糖核酸提取，(3)注意事项，6。建立一个专门的实验室进行核糖核酸操作，所有的仪器都要专用。7.防止核糖核酸酶污染(1)核糖核酸酶可以经受各种处理而不失活，如煮沸和高压灭菌等。(2)严格控制外源核糖核酸酶的污染：外源核糖核酸酶存在于操作人员的汗水和唾液中，也

6、可能存在于灰尘中，造成仪器、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手和各种试剂的污染。(3)最大限度地抑制内源性核糖核酸酶；各种组织和细胞中都有大量的内源性核糖核酸酶。2020/8/7、核糖核酸保存，溶于无核糖核酸酶的水或TE中，在-70或更低温度下保存不到一年，但避免重复冷冻和解冻，并应单独保存。从富含核糖核酸酶的样品(如胰腺和肝脏)中分离的核糖核酸应溶解在去离子甲酰胺中，并在-70下保存至少一年。为了使用核糖核酸，可以加入NaAc至最终浓度为0.3M，在12000g离心5分钟，用70%乙醇洗涤，然后用无核糖核酸酶的水或te溶解。逆转录聚合酶链反应的原理和方法，2020/8/7，实验原理，1

7、。单拷贝基因表达有一个逐渐放大的机制。2.聚合酶链反应技术，即聚合酶链反应。反应分为三个步骤：变性、退火和延伸。3.逆转录酶。第一条链可以用核糖核酸作为模板合成，或者互补的双链可以用第一条链作为模板合成。可见，逆转录聚合酶链反应是一种将基因合成与聚合酶链反应技术相结合的快速、灵敏的基因表达分析方法。核糖核酸模板、逆转录酶、脱氧核糖核酸-核糖核酸杂交双链、核糖核酸被核糖核酸酶降解、单链脱氧核糖核酸、脱氧核糖核酸聚合酶、逆转录聚合酶、Taq酶、2020/8/7、1、引物的特异性决定了聚合酶链反应的特异性。2.掌握引物设计的原则：(1)引物长度一般为：1530 BP(2)碱基分布(3)3-末端要求(

8、4)引物二级结构(5)引物之间的二级结构(6)同源序列(7)5-末端无严格限制、操作步骤，(1)引物设计，2020/。操作步骤，(2)核糖核酸提取，2020年8月7日，(1)两步逆转录聚合酶链反应，(2)操作步骤，(3) cNDA合成，一个普通反应系统10RT反应缓冲液2ul dNTP混合物(各10mm)2ul核糖核酸酶抑制剂(40 u/ul) 0.5 ul寡核苷酸(dt) 18 1ul逆转录酶1ul总核糖核酸0.51ug DEPCfree水组成该系统，2020年8月7日。(1)两步逆转录聚合酶链反应、操作步骤；(3) cNDA合成，操作b，加入8ul总RNA溶液，0.2ml Ep管，在小型离

9、心机中离心几秒钟，置于聚合酶链反应仪中4230分钟(合成cDNA第一链)和855分钟(灭活逆转录酶)。(2)一步逆转录聚合酶链反应、和操作步骤；(3) cNDA合成。在一步逆转录聚合酶链反应中，逆转录和聚合酶链反应在同一试管中进行，条件是同时进行逆转录和聚合酶链反应。优点：处理大量样品时操作简单；减少残留污染；并且可以获得更高的灵敏度。缺点：无法优化反应条件；万一失败，总核糖核酸必须重新提取。2020年8月7日，(2)一步逆转录聚合酶链反应，操作步骤，(3) cNDA合成，0.1-1微克总核糖核酸200-50ul umol/L dNTP(每种)0.5umolL基因特异性引物(上游和下游)200

10、 U AMV逆转录酶1Taq聚合酶缓冲液0.5，2020/8/7，(1)50ul聚合酶链反应系统的组成(即一步法):操作步骤，(4)聚合酶链反应扩增，2020/7(2)此外，Mg2浓度的调节也非常重要。通常，最佳浓度是左右各2mM。(3)引物和模板的数量。操作步骤，(5)聚合酶链反应条件的优化，2020年8月7日，根据产品长度(不同长度产品所需的凝胶浓度)制备适当浓度的琼脂糖凝胶。取适量的聚合酶链反应产物，加入样品缓冲液，充分混合，将样品放入制备好的琼脂糖凝胶样品孔中，以10V/cm的速度电泳4560分钟。成像系统的成像分析。操作步骤；(6)产品电泳及结果测定、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用；

11、2020/8/7，实验性pr，incipe，1。琼脂糖是一种链状多糖。用绳状琼脂糖束大网凝胶2分离、鉴定和纯化DNA。影响DNA迁移率的因素：DNA分子大小、构象、凝胶浓度、电压、do物质、2020/8/7、染色和拍照、电泳、样品制备和添加、电泳类型的选择、电泳缓冲液系统的选择、琼脂糖凝胶的制备、2020/8/7、用于核酸分离的电泳类型的选择，步骤，无关紧要，2020年8月7日，选择缓冲系统。常用的电泳缓冲液有乙二胺四乙酸(pH8.0)、三乙酸(TAE)、三硼酸或三磷酸等。浓度约为50mmol/L (pH7.57.8)，STEPS，不要紧，2020/8/7，凝胶制备，用稀释的电泳缓冲液作为溶剂

12、，在微波炉中制备一定浓度的溶胶，装入水平胶框或垂直胶膜中，插入梳子，自然冷却。步骤，无关紧要，2020年8月7日，样品制备和添加，用适量的Tris-乙二胺四乙酸缓冲液溶解脱氧核糖核酸样品，其中含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，10%-15%蔗糖或5%甘油，以增加其比重和浓缩样品。STEPS，2020/8/7，电泳，在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。因此，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。STEPS，2020/8/7，染色和摄影，常用荧光染料溴化乙锭(EB)染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行相关数据分析。(1)影响琼脂糖凝胶电泳的因素，DNA分子的大小：实验表明，DNA片段的迁移距离与其分子量的对数成反比；琼脂糖浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝胶中具有不同的电泳迁移率；DNA分子构型：不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差异很大，2020/8/7、结果分析，(2)常见问题的原因及解决方法，2020/8/7、结果分析，(2)常见问题的原因及解决方法，2020/8/7、does matt