4质粒DNA转化.ppt

1、实验四、质粒DNA的转化,学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选阳性克隆的方法。,实验目的,学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选阳性克隆的方法。,实验原理,转化 用CaCl2处理细菌可以提高细菌吸收周围环境中的DNA分子,这种状态的细菌被称为感受态细菌。 在转化混合液中，相对于细菌，外源DNA通常是过量的。DNA的结合状态跟游离状态是相互平衡的过程，达到平衡点的时间大约是20分钟。 DNA跟细菌表面的结合不是十分紧密，任何的振动都可能使DNA脱离细菌表面，导致转化效率降低。,在冰浴中，DNA以Ca-DNA复合体的形式结合于细菌细胞表面,冰冷条件下，CaCl2能使细菌细胞膨胀，细胞

2、壁通透性增强，转移到42下进行短暂热刺激，待转化的外源DNA便会被细胞所吸收,突然增加温度（42）然后突然降低温度（冰浴），一个或多个结合到细胞表面的DNA分子被细胞吸收,2、重组子筛选,重组子筛选： 这和受体菌及质粒的选择相关， 原则上要注意： 受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株； 限制性内切酶缺陷(R）,-不含限制性内切酶 甲基化酶缺陷（M),-不含甲基化酶 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。 例如：E.coli DH5基因型： 氨苄青霉素抗性缺陷(Amp-),抗生素筛选法： 菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生

3、素的培养基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。,互补筛选法： pUC18 上带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和-半乳糖苷酶N 端146 个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点 受体菌则含编码半乳糖苷酶端的序列。 E. coli DH5菌株带有-半乳糖苷酶C 端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下, pUC18 和DH5编码的-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pUC18 和DH5融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫-互补。当外源基因插入时，二者溶为一体后

4、，有半乳糖苷酶表达， 在生色底物溴氯吲哚半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。 由-互补产生的Lac+细菌在生色底物X-gal存在下形成兰色菌落。外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，导致产生无-互补能力的氨基片段，因此带重组质粒的细菌形成白色菌落。,操作步骤,1、取100L感受态细胞悬液，加入1L连接产物（重组质粒）（在冰上操作），轻轻摇匀，冰浴20min。 2、42水浴中热激90s （或 37水浴 5min），热激后迅速置于冰上冷却5min。 向EP管中加入1mL LB液体培养基（不含 Amp），混匀后37振荡培养 1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）。 3000 rpm 离心 5min。 弃去1ml上清，余下全部样品（约0.1ml），用枪轻轻吹匀，吸至含Amp的筛选平板上，均匀涂布。正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37培养16-24h。,阴性对照组,注意事项： 制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染。 42热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。 菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。,思考题,如果实验中对照组本不该长出菌