食品中过敏原成分环介导等温扩增LAMP检测方法第21部分胡萝卜征求意见稿

1、发布中 华 人 民 共 和 国国家质量监督检验检疫总局 -实施-发布食品中过敏原成分环介导等温扩增（lamp）检测方法第21部分：胡萝卜loop-mediated isothermal amplification detection method for allergen components in foodpart 21:carrot（征求意见稿）sn/t sn中华人民共和国出入境检验检疫行业标准前 言sn/t 的总题目是食品中过敏原成分环介导等温扩增（lamp）检测方法，由下列部分组成：第1部分：开心果第2部分：胡桃第3部分：腰果第4部分：榛子第5部分：杏仁第6部分：巴旦木第7部分：巴西坚

2、果第8部分：澳洲坚果第9部分：栗子第10部分：羽扇豆第11部分：葵花籽第12部分：芝麻第13部分：芥末第14部分：花生第15部分：大豆第16部分：小麦第17部分：大麦第18部分：荞麦第19部分：牛奶第20部分：虾第21部分：胡萝卜第22部分：芹菜本部分为sn/t 的第部分。本部分按照gn/t 1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出。本部分由全国进出口食品检测标准化技术委员会（sac/tc445）归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、山东出入境检验检疫局本部分主要起草人：孙敏、高

3、宏伟、龚方、刘彩霞食品中过敏原成分环介导等温扩增（lamp）检测方法第21部分：胡萝卜1 范围本标准规定了食品中过敏原胡萝卜成分特异性的环介导等温扩增（lamp）检测方法。本标准适用于食品中过敏原胡萝卜成分特异性的定性检测。本方法的定性检测低限为0.001%（w/w）。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。gb/t 6682 分析实验室用水规格和试验方法gb/t 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语、定义和缩略语3.1 过敏原 alle

4、rgen 又称致敏原或变应原，是指能够引起变态反应的抗原。3.2 胡萝卜 carrot 别名：胡芦菔，红萝卜,又称甘荀，属伞形科（apiaceae）胡萝卜属（daucus l.）。 。3.3 dntp（deoxyribonucleoside triphosphate）：脱氧核苷三磷酸3.4 lamp（loop-mediated isothermal amplification）：环介导等温扩增3.5 triton x-100：聚乙二醇辛基苯基醚4 防污染措施环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合gb/t 27403-2008中附录d的规定。5 方法提要样品经研磨后，提取dna，以dna为模板

5、，采用胡萝卜its1-5.8srna-its2基因特异性检测引物进行lamp扩增，通过颜色变化观察判定是否存在过敏原胡萝卜成分。6 lamp检测方法6.1 原理根据胡萝卜its1-5.8srna-its2基因序列设计特异性内引物、外引物各一对，特异性识别靶序列上的六个独立区域，利用bst dna聚合酶启动循环链置换反应，在胡萝卜its1-5.8srna-its2特异靶序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环dna混合物；从dntp析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。显

6、色液显色原理：sybr green i是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，sybr green i发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，sybr green 的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出lamp反应体系存在的双链dna数量。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器（分子生物学级别）。6.2.2 水浴锅或加热模板：65 1 和80 1 。6.2.3 离心管：0.1 ml、1.5 ml。6.2.4 计时器。6.2.5 移液枪：量程0.5 l10 l、量程10 l100 l、量程100 l1000

7、l。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水：应符合gb/t 6682中一级水的规格。6.3.2 dntps溶液：每种核苷酸浓度25mmol/l。6.3.3 bst dna聚合酶：酶浓度8 u/l。6.3.4 10thermolpol缓冲液：含200 mmol/l tris-hcl（ph 8.8）、100 mmol/l硫酸铵、100 mmol/l 氯化钾、20 mmol/l硫酸镁、1% triton x-100。6.3.5 硫酸镁溶液：100 mmol/l。6.3.6 甜菜碱：5 mol/l。6.3.7 显色液：sybr green i 荧光染料，10

8、00 。6.3.8 引物：根据胡萝卜its1-5.8srna-its2基因设计一套特异性引物，包括外引物f3/b3，内引物fip/bip，见表1。表1 引物序列名称编号序列lamp引物序列外侧上游引物（f3）5- gaaattggcctcccgtgc -3外侧下游引物（b3）5- gcttaaactcagcgggtagt -3内侧上游引物（fip）5- aaccaccgatgtcgcgatgccttttgtgtgcggttggc -3内侧下游引物（bip）5- gtcgttgtgtatacccgccgcgggtcacaatcgaagtgca -3上游环引物（lf）5- cgtcaccagaga

9、ctcatttttga -3下游环引物（lb）5- ggcccttgggcacagcaaa -36.4 实验步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：采用不含有待测基因序列的植物基因组dna为模板。阳性对照：采用含有待测基因序列的植物dna作为模板或含有目的基因序列的质粒dna代替dna模板。设两个空白对照：提取dna时设置的提取空白对照（以水代替样品）；lamp反应的空白对照（以dna溶解液代替dna模板）。6.4.2 胡萝卜lamp反应体系lamp反应体系见表2。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品dna溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1

10、 l显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中。表2 过敏原胡萝卜成分lamp反应体系组 分工作液浓度加样量（l）反应体系终浓度thermopol缓冲液10 2.51 外侧上游引物（f3）10 mol/l0.30.12 mol/l外侧下游引物（b3）10 mol/l0.30.12 mol/l内侧上游引物（fip）10 mol/l2.40.96 mol/l内侧下游引物（bip）10 mol/l2.40.96 mol/l上游环引物（lf）10 mol/l1.20.48mol/l下游环引物（lb）10 mol/l1.20.48mol/ldntps25mmol/l1.31.3 mm

11、ol/l甜菜碱5 mol/l40.8 mmol/l硫酸镁100 mmol/l1.56 mmol/lbst dna聚合酶8 u/l10.32 u/ldna模板10 ng/l20.8 ng/l水4.96.4.3 lamp反应参数63 恒温扩增60 min，80 5 min使酶灭活，反应结束。6.4.4 显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，在黑色背景下立即进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则：实验室中设置的各种对照lamp检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 空白对照：反应管中液体呈橙色。6.5.3 阴性对照：反应管中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照：反应管中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管中