体外诊断试剂培训PPT课件.ppt

1、体外诊断产品的生产监管,北京市医疗器械检验所,主要内容,体外诊断产品的种类 体外诊断产品生产的基本原理 生化类产品 免疫类产品 分子类和血液类 溯源性问题,体外诊断作用“医生的眼睛”,预测和诊断功能，如： 血细胞 抗体（肝炎、艾滋、IGE） 基因（唐氏、小儿耳聋、遗传缺陷基因BRCA1）。,疗效和健康监测，如： 代谢物（血糖） 标志物（AFP、PSA、HPV） 蛋白、微量元素（白蛋白、Ca);,体外诊断产品的类别,体外诊断根据风险分3类： III类：致病性病原体抗原、抗体以及核酸、人类基因检测、肿瘤标志物、血型、组织配型、变态反应（过敏原）等； II类：除III、I类，如：蛋白质、糖类、酯类、

2、酶类、维生素、无机离子、激素等； I类：微生物培养基（不用于微生物鉴别和药敏试验）、样本处理用产品，如溶血剂、稀释液、染色液等。,体外诊断产品的类别,体外诊断专业分类:生化、免疫、分子生物学、微生物、体液等,临床使用超过千种。 生化：生物化学反应或免疫反应(生化仪的项目），酶类、糖类、脂类、蛋白、无机元素、肝功能、肾功等指标。 免疫：抗原与抗体相结合的特异性反应，传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、血型鉴定等。 分子诊断：分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化，主要用于肝炎、性病、优生优育、遗传病基因、肿瘤等检测。,体外诊断产品的类别,微生物：通过培养鉴别细菌等微生物的方法。

3、 血液学：通过电阻抗、激光和高能电磁波等技术检测血液中血细胞的数量和分类的方法。,生化类产品基本方法,生化分析仪反应的一般称为生化试剂 两点法、终点法、速率法、比浊法 两点法： 测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变化量以求取酶反应初速度的方法。 终点法： 通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法。 速率法： 是指连续测定(每15秒1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产物或 底物的浓度随时间的变化来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法。 透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目。,生化类产品基本方法,终点法常用的有

4、总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）。 两点法：苦味酸法测定肌酐采用此法 速率法对于酶活性测定，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。（7个酶加葡萄糖、尿素） 免疫比浊法载

5、脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗“O”、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。(蛋白）,生化类产品说明书,生化分析仪说明书除法规相关规定外，还至少包括： 适用机型 反应温度（37度） 主波长、次波长 孵育时间（终点法或两点法） 延迟时间（连续监测法）、连续监测时间在延迟时间之后即开始，一般为60120s不少于4个吸光度检测点（3个吸光度变化值）； 加样量 校准液个数（非线性必须两个以上）等。,标准液个数的原因,校准液个数浓度校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采用一个校准液；线性好但不通过坐标零点，应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校

6、准液。每一个校准液都要有一个合适的浓度。 吸光度,浓度,10,5,6000,3000,8,生化类产品基本原理,氧化反应:,还原反应：,生化类产品质量风险点分析,原材料(辅酶I )（进货检验记录或生产记录中，应包括辅酶空白吸光度的检验记录，且不同的类别符合下述特点） 还原性辅酶I主要用于下降反应，当还原性辅酶I质量出现问题时，试剂的空白吸光度降低，导致试剂测量结果的不确定度变大，测量的灵敏度也随之降低，测量线性范围变小。 氧化性辅酶I主要用于上升反应，当氧化性辅酶I质量出现问题时，试剂的空白吸光度升高，导致试剂测量结果的不确定度变大，测量的灵敏度也随之降低，测量线性范围变小。,生化类产品质量技术

7、风险点分析,生产记录中应包括试剂用水的电导率、PH值及微生物检验记录,生化类产品质量风险点分析,免疫类产品基本原理,Elisa反应的基本原理（酶标仪、发光仪等） 将含有已知抗体的抗血清吸附在微量滴定板上的小孔里，洗涤一次；加待测抗原，如两者是特异的，则发生结合，然后把多余抗体洗除；加入与待测抗原呈特异反映的酶联抗体（二抗），使形成“夹心”；加入该酶的底物，若看到有色的酶解产物产生，说明在孔壁上存在相应的抗原。,免疫类产品质量技术风险点分析,辣根过氧化物酶 过氧化物酶（HRP）广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和

8、403nm。 酶的纯度以RZ表示：RZ=OD403/OD275 纯酶的RZ多在3.0以上，最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占 75%，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。（检查进货检验记录或生产过程记录）,免疫产品质量风险点分析,酶与抗体的活性常用琼脂扩散或免疫电泳法，使抗原与抗体形成沉淀线，经PBS漂洗1天，再以蒸馏水浸泡1小时，将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色，如果出现应有的颜色反应，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表示结合物既有酶的活性，也有抗体活性。良好的结合物在显色后，琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA方法

9、进行方阵滴定，此法不仅可以测定标记效果，还可以确定酶标抗体的使用浓度。,免疫类产品质量风险点分析,在产品进货检验记录或生产记录中检查以下内容： 1、酶标记二抗的活性； 2、用于ELISA的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般，为500(g/ml时效果较好，达 1000(g/ml时效果最好； 3、酶结合率为 7%时效果一般，为9%10%较好，达30%以上最好； 4、一抗进货检验记录，单抗还是多抗，也可小样测试活性； 5、一抗包被的工艺记录与质量体系文件中要求是否一致； 5、储存环境同生化产品；,分子类产品基本原理,PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95高温时变性会变成单链，低温（

10、经常是60C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。,分子类产品质量风险点,1、引物质量，多为购买，可做小样，采购记录中查小样测试记录； 2、聚合酶质量，多为购买，可测定，可做小样，采购记录中查小样测试记录； 3、内标：已知带有引物片段样本，与被测样本同时扩增，应显示阳性，检查测试记录； 4、PCR生产企业控温精度（95度、55度和75度）和变化率的记录。 5、实地检查PCR试剂的质控（内

11、标）和生产是否在各自独立的建筑中进行。并且实验室分为试剂配制区、样品处理区、核酸扩增区、产物分析区。并且考虑房间的正负压保护样本不被污染、人员不被感染。,95度(高温）,55度低温,75度（反应温度）,95度,血液类产品基本原理,悬浮在电解液中的颗粒/细胞，随电解液通过小孔管时，因取代了相同体积的电解液，在恒电流设计的电路中导致小孔管内外两电极间电阻发生瞬时变化，而产生了电位脉冲。脉冲信号的大小和次数与颗粒的大小和数目成正比。,血液类产品质量控制点,1、生产记录中检查溶血剂、稀释液的颗粒物、微生物检验记录； 2、血细胞分析仪稀释液生产车间需控制洁净度和菌落数； 3、检验室的血液分析仪是否采用定

12、值血定期校准； 4、检验室的血液分析仪内部质控结果，红白偏差是否符合要求（特别是血小板）。,体外诊断试剂溯源,校准液个数浓度校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采用一个校准液；线性好但不通过坐标零点，应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校准液。每一个校准液都要有一个合适的浓度。 吸光度,浓度,10,5,6000,3000,8,2009年国家食品药品监督管理局体外诊断试剂监督抽验 61个国产TG试剂,新鲜混合血清 最大正偏倚为22.1，最大负偏倚为-18.9，39% bias 5,体外诊断试剂溯源,校准品与质控品区别 校准品目的是为了产品的准确性，溯源性是必须的； 质控品目的

13、是为了产品的精密度，稳定性是必须的，可不具备溯源性。,溯源性有多重要？ 临床检验：对收集的患者标本只做一次检验，就发出报告 准确性不足是重要的临床检验质量问题 影响检验结果“临床准确性”的因素是多方面的 样品采集与处理，病人准备，(生物变异)，人为错误 方法：正确度（校准）、精密度、特异性、线性、检测限等 溯源理论上解决的是正确度问题(校准问题),体外诊断试剂溯源,体外诊断试剂溯源,标准物质,制造商选定方法,主校准品,制造商常设方法,产品校准品,常规方法,血样,体外诊断试剂溯源,1、有溯源性才能判断准确性； 2、检验结果才能互认； 目前问题 1、CRM缺乏； 2、反应原理差异，导致结果有差异，但Cutoff值也不同，不影响临床判断，结果无法互认； 3、各自溯源路径不同，结果存在差异。,体外诊断试剂溯源,目前采用的准确性评价方法 1.国家标准物质、国际标准物质（有溯源性）（查验标准物质证明材料，一般为证书） 2.回收实验（有一定溯源性）（添加物质纯度，实验记录） 3. 与