PCR技术原理及其应用

1、PCR技术原理及其应用，1 PCR技术原理2 PCR技术应用，第一节PCR技术原理，1，PCR技术简史，DNA复制聚合酶链反应的发明，PCR技术简史，DNA复制聚合酶链反应的发明，引物酶，引物酶，DNA聚合酶，PCR DNA的复制聚合酶链反应的发明，PCR技术的简单历史，DNA的复制聚合酶链反应的发明，Kary B. Mullis，1989年美国Science杂志列PCR是10项重大科学发明的第一位，引物，引物，MCR DNA聚合酶，DNA聚合酶，特定DNA片段，Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus )首先等待放大的DNA模型的加热变性解链，随之将反应混合物冷却到某一温度，

2、该温度退火引物及其目标序列该热变性复原性伸长的过程是PCR循环，PCR在适当的条件下是该循环的重复。PC循环步骤1 -目标样板动态图(95oc )、目标序列、目标序列、pcr原理示意图、模板dna的改性、PC循环步骤2 temper andprimersannealtotarget序列、目标序列、目标序列。 3、3、模板DNA和引物退火(恢复性):模板DNA经加热变性成单链后，温度下降55左右，引物和模板DNA单链的互补序列成对结合。PC rcycle-step3- at72 octaqdnapolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynu

3、cleotidesareincorporated，目标设置目标序列、end of the1 stpcrcycleresultsintwocopiesofTarget Sequence、Target Sequence、target sequence在每次循环完成时需要24分钟，将在23小时内扩展的基因放大数百目标应用程序，no.ofno.ampliconcyclescopiesoftarget 122438416532664201、048、576301、073和741。 2个循环=4个苹果、3个循环=8个苹果、4个循环=16个苹果、5个循环=32个苹果、6个循环=64个苹果。 三、PCR反应、P

4、CR反应条件PCR过程PCR的特征、PCR计、PCR反应、PCR反应条件PCR过程PCR的特征、PCR反应、PCR反应条件PCR过程的特征DNA单链和引物的恢复性、DNA改性形成两条单链，子链延长DNA PCR的基本原理、PCR反应条件PCR过程PCR的特征、引物1、引物2、 PCR的基本原理、PCR反应条件PCR反应条件PCR过程PCR的特征、第一回合结束、第二回合开始、PCR的基本原理、PCR反应条件PCR过程PCR的特征、Taq、Taq PCR的基本原理、PCR反应条件PCR过程PCR的特征铸模DNA、第一次放大、第二次放大、第三次放大、第四次放大、第五次放大、第六次放大、理想拷贝数=2

5、n循环次数实际拷贝数=(1x PCR反应条件PCR过程PCR的特征是， 以DNA为模板的反应体积： 50100l缓冲液底物： 4种dNTP模板： 102105复制TaqDNA聚合酶矿物油、4、PCR反应体系、以mRNA为模板的反应(逆转录PCR )逆转录反应体系体积： 20 l缓冲液底物： 4种dNTP 1218模板： RNA逆转录酶及其他试剂： RNA酶抑制剂、MgCl2.DTT .牛血清白蛋白ppt蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类不能被混合。 一般的100ng DNA模板/100L。 铸模浓度过高会导致反应的非特异性增加。 (2)引物浓度0.1-0.5 mol/L浓度过

6、低会影响产量，过高会引起错配和非特异性生成物的增加，可提高引物二聚体的发生概率。 (3)Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l酶量的增加使反应特性降低。 酶量过少会影响反应产量。 (4)dNTP 20200mol/L dNTP浓度依赖于扩增片段的长度的4种dNTP浓度如果相同浓度过高，则容易引入错误的碱，如果浓度过低，则反应生产量降低，但如果特异性地增加dNTP，则与Mg2结合，使游离的Mg2浓度降低，DNA聚合(5) Mg2、Mg2是DNA聚合酶的活化剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2浓度过低会失去Taq酶活性，P

7、CR产量下降Mg2过高会影响反应特异性。 由于Mg2与负离子结合，反应体系中的dNTP、EDTA等浓度影响反应中游离的Mg2浓度。 调节反应体系的pH，使1050mmol/L Tris-Cl缓冲液、72时pH 7.2、Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。 含有50 mmol/L缓冲液的KCl促进引物退火，超过该浓度时抑制TaqDNA聚合酶的活性。 添加适量的二亚甲基亚砜和甲酰胺有利于破坏模板的二次结构。 (6) PCR反应的缓冲液，(2)循环残奥计(1)改性94oC95oC，30-60 s，并且在最初加入Taq酶之前比97oC充分改性510min (2)退火50oC55oC，60-90

8、s的温度降低的话，反应的灵敏度提高。 (3)拉伸70oC74oC、60-120 s拉伸时间由扩增片段的长度决定；(4)循环数主要取决于模板DNA的浓度，一般25-35次的次数过多：非特异扩增随着目标DNA产物的逐渐积累，扩增DNA片段的增加进入相对稳定的状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。达到平台期所需的PCR循环次数取决于样本中模板的副本数、PCR扩增效率、DNA聚合酶的种类和活性以及非特异性产物的竞争等因素。 在达到平台期之前，TaqDNA聚合酶一般进行25次以上的PCR循环。 平台期多为PCR反应所不可避免。 PCR产物积累规律示意图；(1)一般原则引物长度为1530个碱基。 引物

9、过短会降低特异性。 如果过长，相应的退火温度上升，合成底漆的成本增加。 引物中碱的分布是随机的，避免4个以上的嘌呤和嘧啶的连续序列，G C含量最好是4555左右。 五、PCR引物的设定修订避免了两引物之间的互补性，特别是三端互补性，使之不形成二聚体。 引物本身不能连续存在超过3bp的互补序列。 否则，底漆本身会折叠成发夹结构或底漆本身变性。 引物的3端不能进行任何修饰，也不可能形成二次结构。 引物的5端限定了PCR产物的长度，可以根据产物的要求选择不同的引物修饰法。 引物和非扩增序列的同源性不得超过70。 将模板序列直接发送到特定的网页。 例如： http:/基因- www2.标准. edu/

10、CGI-bin/SGD/we b -主机。 /引物设定修订软件。 功能：首先是引物分析评价功能，其中“Oligo 6”最好，其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同。 (二)引物修饰的方法，六、PCR产物的检测，(一)琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化和鉴定PCR扩增产物最常用的方法。 其分辨率高，可以测定1ng的dna。 一般800bp以上的段为0.8%的橡胶，800bp以下的段为1.0%2.0%的橡胶。 比琼脂糖凝胶电泳灵敏度高，主要用于分离制备长度小于1kb的低分子质量基因片段，特别适用于合成的基因片段的分离和检测。 适用于PCR扩增效率

11、低时产物的检测。 根据扩张片段的大小选择适当的凝胶浓度，电泳后可用银染或溴乙锭染色检测，银染比EB染色检测灵敏度高210倍。 (二)聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC )是一种基于常压发展起来的现代化分析技术，其特点是分离速度快、效果好，是目前广泛用于基因片段分离纯化的方法之一。 离子交换色谱(IEC )的基础是溶质分子具有的电荷，合成的基因片段正好具有这一性质。 因此，IEC分析广泛应用于DNA的合成及其扩增后的分离纯化。 (3)层析技术需要进行分子杂交检查，以判断PCR产物是否为预先修订的目标片段，或者产物是否有突变。 分子杂交包括点杂交和Southern印迹杂交。 点杂交灵敏度高

12、，特别适用于非特异性PCR扩增产物的分析。 Southern印迹杂交可鉴定PCR产物的大小和特异性，检测灵敏度可达10ng。 基本过程是PCR产物进行常规琼脂糖凝胶电泳，然后印迹转移到尼龙膜上，用标记探针进行杂交检测。 (4)分子杂交只要知道PCR扩增片段的序列和限制酶切图像，就可以选择合适的限制酶消化PCR产物，进行电泳分析，从PCR酶切产物的电泳图像判断PCR产物有无特异性和突变。 (6)PCR扩增产物的直接测序直接序列分析是一种基于PCR扩增基因组DNA序列进行直接基因核苷酸序列分析的方法，是检测基因突变最有效、最直接的方法。(5)限制性内切酶切分析，7，PCR应注意的事项，(1)将防污

13、染试剂少量分装吸头和Ep管一次性容器和工作区分离，无菌操作(2)对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板试剂对照：模板外所有成分第二节PCR技术的应用PCR技术的主要类型，反PCR锚点PCR非对称PCRinsituPCRrtPCR重组PCR差异呈现PCR免疫PCR实时定量PCR复用PCR，1 )反向PCR (反向PCR )，并邻近用反向互补引物放大的已知DNA片段克隆，插入扩增基因库DNA，仅知道部分序列的全长cDNA，扩增未知序列后可进行分析； 创建基因组阶跃迁移库。已知序列、未知序列、未知序列、限制酶、2 )非对称PCR目的：扩增特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。 分别称为限制引物和非限制引物，其最佳比例一般为0.010.5M，限制引物的绝对量很重要。 用途：核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究、高浓度、mRNA、cDNA、杂交双链、基因、mRNA、蛋白质多肽链、4 )多重PCR :一个反应体系结果，生成了用于检测特定基因序列的存在或