微生物检测技术在基层突发公共卫生事件中的综合应用及分析

1、微生物检测技术在基层突发公共卫生事件中的综合应用及分析,成都市CDC 黄薇 2014年11月,水和食品等的微生物污染是突发公共卫生事件中最大的危害及主要的致病因素 60-70%由病原微生物引发，患病的人数约为化学引起疾病人数的两倍 波及面大，发生频率高，常常造成较大的损失和危害而成为一个日益受到关注的公共卫生问题。,需要解决的问题,生物or化学？ 可疑食物？ 样品采集？ 检测项目？ 检验方法？ 结果解释？,突发事件之一,流行病学调查,家庭餐，4人 共同进餐：米饭、回锅肉、皮蛋、炒素菜、白菜豆腐汤,临床症状：第二天发病，均为呕吐、腹泻、水样便310次/天 临床诊断为急性胃肠炎和急性细菌性痢疾 2

2、人未服药，2人已进行输液治疗,抽丝剥茧,可疑食物 比较明确 生物or化学 很明确 初步判断,样品采集,可疑食物：皮蛋2份（1份采自干杂铺的同一批皮蛋、1份为病人尚未食用的皮蛋） 病人样品：肛拭4份 、呕吐物1份 比较简单，易判断,检测项目,志贺菌 沙门菌 鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌,检验方法,常规检测 PCR检测 产物测序 PFGE,常规检测,直划平板 增菌培养时间 接种平板 挑选可疑菌落TSI几个？ 生化试验 血清学试验,PCR,常规PCR：沙门菌的靶基因为InvA，产物长度为316bp，引物序列为：A1: 5-AACAGTGCTCGTTTACGACC-3，A2: 5-CCAGGCTATCGC

3、CAATAAC-3 荧光PCR：试剂盒,PCR产物测序：委托上海之江生物科技有限公司测定 PFGE：中国CDC腹泻病室提供,常规PCR扩增结果,M：marker；14：病人肛拭；5：病人呕吐物；6：市售皮蛋；7：皮蛋；8：德尔卑沙门菌（CMCC50719）；9：阴性对照,荧光PCR-沙门菌扩增曲线,1：德尔卑沙门菌（CMCC50719）；25：病人肛拭； 6：呕吐物；7：市售皮蛋；8： 病家皮蛋,荧光PCR-志贺菌扩增曲线,1：福氏志贺菌（CMCC51571）；2：阴性对照； 其余为病人肛拭4份、呕吐物1份、皮蛋2份,测序结果,扩增长度为300bp左右的产物测序结果经与Gen-Bank数据库中

4、的序列比对，其序列和沙门菌的同源性为99%,扩增长度为1000bp左右的产物测序结果经与Gen-Bank数据库中的序列比对，其序列和大肠埃希菌的同源性为99%,Spe I酶PFGE图谱,M：Mark；12：病人肛拭分离株；3：市售皮蛋分离株,Xba I酶切PFGE图谱,M：Mark；12：病人肛拭分离株；3：市售皮蛋分离株,用SpeI及XbaI酶切后的PFGE分型，两个病人肛拭及市售皮蛋中分离出的菌株帶型完全相同 3株不同来源的菌具高度同源性,结果应用和分析,3种方法在相同的两个病人肛拭中均检出沙门菌，培养法在市售皮蛋中亦检出沙门菌，但常规PCR及荧光PCR均未检出,常规PCR及荧光PCR均在

5、10h增菌培养（2h前增菌+8h选择性增菌）后进行，再经6h后得到常规PCR结果，4h后得到荧光PCR结果，培养法在增菌18 h后进行分离培养，5天后得到结果,检出限：常规PCR为105 Copies/ml，荧光PCR为103Copies/ml,应用常规PCR及荧光PCR检测病原菌时，病人粪便、肛拭等病源性检样的增菌时间在10h甚至可能可以更短，但食品、水等非病源样品的增菌时间应适当延长,来源不同的3株菌生化反应不一致 PCR产物测序及PFGE分型结果则表明污染了皮蛋的鼠伤寒沙门菌来源相同 很好地进行了溯源,PCR检测,假阳性：核酸污染 假阴性：菌量低或酶抑制物的存在,实验室建设的规范 实验室

6、质量管理体系的建立 自动化仪器（荧光PCR仪等）的出现 方法的标准化成为可能,美国农业部食品安全检疫署等国际官方检测机构已将PCR方法作为快速检测方法编写成实验室标准操作程序 我国出入境检验检疫局也制定了用实时PCR法检测食品中致病菌的行业标准,突发事件之二,事件,2010年9月 成都市某乡镇中心卫生院及县第二人民医院 发热患者 个别患者有轻微腹泻 均为当地9所学校在校学生 症状符合？,第一次调查和处理,根据初期症状和流行病学调查，实验室进行了呼吸道病毒的核酸检测，均为阴性 诊断为不明原因发热,采取针对呼吸道传播疾病的控制措施后，疫情未得到有效控制，3天中发病范围继续扩大，发病人数快速增长 怎

7、么办？,第二次调查和处理,进一步流行病学调查后，排除食物污染途径，怀疑可能与供水污染有关 采集样品：乡镇水厂、学校的自备水以及患者咽拭和肛拭 确定项目：进行肠道病毒和细菌的检测,检测项目和方法,常规法 指标菌：总大肠菌群、大肠埃希氏菌水样 细菌致病菌培养：水样和病人肛拭,PCR法 肠道病毒：诺瓦克病毒 细菌：产毒素大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、副溶血弧菌）,10份水样指标菌检测结果为6份水样总大肠菌群和大肠埃希菌均超过生活饮用水卫生标准，提示水样已受到温血动物粪便污染 常规培养则仅在患者肛拭中分离到宋内志贺菌,PCR检测-样品,水样6份 经抽滤富集未经增菌混合水样2份：1份为镇水厂出厂水、镇五小

8、学生宿舍管网水、镇四小过道管网水混合，1份为镇一、二小管网水混合 5份重点可疑水样8h增菌后肉汤,患者肛拭4h增菌后1%氯化钠肉汤,结果,所有样品均未检出产毒素大肠埃希菌、沙门菌和副溶血弧菌 混合水样和9例患者肛拭4h增菌液均为志贺菌阳性，镇水厂进厂水、镇初级中学自备水为志贺菌阴性,5份重点可疑水样经1%氯化钠肉汤增菌8h后，再次检测志贺菌，均为阳性,水样未增菌与增菌后核酸检测Ct值比较,核酸检测结果显示在9份患者肛拭和5份水样中均检测到志贺菌核酸 该镇无论是水厂水源还是自备水源普遍受到志贺菌污染,指标菌、常规培养及核酸检测结果与各学校发病情况一致，表明此次暴发疫情是由宋内志贺菌污染饮用水引起的,实验室采用酶底物法和荧光PCR技术，在24h内即得到指标菌和致病菌的核酸检测结果，结合水样增菌前后志贺菌核酸检测Ct值变化（增菌后下降）