《核酸生物化学》PPT课件.ppt

1、第十一章 核酸代谢(二),核 酸 的 生 物 合 成,主要内容,DNA的生物合成 RNA的生物合成,遗传学的中心法则,DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。 DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。,反中心法则,在RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中。 因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就称为反中心法则。,信息分子的复制与表达,DNA,mRNA,蛋白质,反转录,复制,复

2、制,翻译,转录,概念:,复制(replication)： 指以亲代DNA分子 为模板合成出子代 DNA分子的过程。 转录(transcription)： 以DNA分子为模板合 成出与其核苷酸顺序 相对应的RNA的过程。,反转录(reverse transcription)：,以RNA为模板将遗传信息传给DNA的过程。,艾滋病“现代瘟疫”,艾滋病的英文缩写AIDS的全称为获得性免疫缺陷综合症（acquired immune deficiency syndrome）。 引起艾滋病的元凶是一种人类免疫缺陷病毒 (human immune-deficiency virus,HIV),HIV的结构,HI

3、V基因组（RNA）进入人体后,专门识别T淋巴细胞(主要免疫细胞,具有抗感染作用)，在逆转录酶的作用下，以HIV的RNA为模板，产生了与RNA互补的DNA链。 再合成DNA互补链,与人染色体基因整合,形成前病毒DNA.(潜伏期) (被激活时)前病毒DNA转录生成新的RNA片段，同时合成衣壳蛋白等， 在宿主细胞中，新合成的RNA、逆转录酶及蛋白质等又装配生成更多的病毒颗粒， 它们以出芽的方式从宿主细胞中释放出来，又去攻击其他的T淋巴细胞。,被HIV感染的T淋巴细胞,一、DNA的生物合成,（一）DNA的半保留复制 1、半保留复制假说的提出： 1953年，Watson 真核生物： 多起点； 2、方向：

4、 多为双向,3、复制叉： 细菌为环状DNA复制起始于单个位点， 双向，半保留，每 个复制泡（眼）包 括2个复制叉(DNA 的两条链在起始点分开形成)。 方向：53,复制叉,大肠杆菌E.Coli 大肠杆菌的复制原点叫做oriCoriC起点：,有固定起点； 特殊蛋白识别起点； 起点为100-200bp的区域; 以复制叉形式完成复制。,（三）原核细胞DNA的复制（DNA指导的DNA合成）,1、大肠杆菌的DNA聚合酶 (DNApolymerase,DNApol)： 催化形成新的磷酸二酯键； 有外切酶活性。,1) E.COLi DNA聚合酶,需要原料： 4种dNTP； DNA模板； 与模板互补的一段RN

5、A引物； Mg2+； Zn 2+ （酶活性部位）；,DNA聚合酶功能：,催化dNTP加到DNA链的3-OH末端 （方向5 3） 。 5 3外切酶活性，可切除引物； 3 5外切酶活性，可纠错；,2) DNA聚合酶:,反应需Mg2+ 、NH4 + ； 反应同酶1,聚合活力很低； 具3 5外切酶活性； 3) DNA聚合酶 ： 主要负责DNA链延伸； 具3 5外切酶活性； 具5 3外切酶活性,DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 亚基数目 1（单体酶） 1（多亚基酶 ） 1（多亚基酶） 5 3聚合活性 + 中 + 很低 + 很高 3 5外切活性 + + + （保护DNA复制的 忠实性fidelit

6、y） 5 3外切活性 + - +,主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。,修复紫外光引起的DNA损伤,DNA 复制的主要 聚合酶，还具有3-5 外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性,E.COLi的DNA聚合酶,功 能 53聚合作用 + + + 53外切酶作用 + + 35外切酶作用 + + + 聚合核苷酸数 /min 600 30 9000 分子数/细胞 400 100 10 *DNApol主要负责DNA链延伸。,2、双链DNA复制的分子机制 （DNA半不连续复制）：,1）冈崎片段和半不连续复制 问题的提出： 已知DNA两条链反向且都能作为模板； 已

7、知DNApol聚合方向53； 冈崎等提出DNA的不连续复制模型，认为： 3 5走向的DNA是由许多53方向合成的DNA片段连接而成的。,实验：,放射自显影； 电子显微镜 观察。 冈崎片段： 以 5 3 走向DNA为模板合成的小片段。 约1000-2000bp。,结论：,DNA是半不连续合成的。 前导链（leading strand): 以35 链为模板，新生链以53方向连续合成； 后随链(lagging strand): 冈崎片段:以3 5链为模板链，DNApol以53方向合成小片段DNA即 由冈崎片段连接成的DNA链为后随链。,2）RNA引物,问题提出： 已知DNApol只能在3-OH上延伸

8、， 什么提供了3-OH？ 实验证明：DNA合成实验需NTP； 新合成的DNA链中有RNA； RNA酶水解证明。, RNA引物酶（RNA primase),为多聚体； 功能： 催化引物合成： 在DNA一定部位合成并与其互补，合成方向53。,RNA引物（RNA primer),引物酶合成的引物为十几个核苷酸。 冈崎片段引物的合成不需要特异的起始部位。, 过程：,A、 引物酶沿复制叉反方向合成后随链引物。 B、 DNApol 在引物上延伸（前导链和后随链）。 C、完成DNA合成后，DNApol 用其53外切酶活性除去引物 。 D、DNA连接酶将两个冈崎片段连接起来。,DNApol ,DNApol ,

9、3） DNA连接酶（ligase）：,作用：催化相邻的二个DNA片段间的连接， 条件：两片段相邻；两片段需与同一互补链结合;反应耗能。,后随链生成包括：,起始：RNA引物的合成； 延长：从引物3端添加dNTP，合成DNA， 终止：切除RNA引物，连接各片段。,4）母本DNA双链的分离,与此相关的酶：,DNA解链酶(DNAhelicase)： 使复制叉前方DNA双螺旋解开一小段。 每解1个bp需耗2个ATP。 单链结合蛋白 （Single Strand Bindingprotein,SSB）： 几分子的SSB与已分开的DNA链紧密结合，以防两链重新结合。 此时，复制酶系统结合在模板链上，进行半不

10、连续复制。,DNA旋转酶（拓扑异构酶,topoisomerase)：,兼内切酶和连接酶活力。 DNA拓扑异构酶，可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。 有ATP时，可使DNA成超螺旋；反之，呈松弛态；,5）DNA聚合酶的校对作用：,依赖于3个聚合酶的3末端外切酶活性，进行校对和纠错。 多种蛋白质参与，从而保证了复制的准确性。,总结：原核细胞DNA的复制,1、合成所需材料： 模板DNA 原料；合成引物所需NTP； 合成DNA所需的dNTP 酶和pr： 2、合成方向：53； 模板链解读方向： 3 5,3、合成步骤：,解链：由DNA解链酶催化，SSB与单链 DNA结合，防止双链间氢键再形成

11、； 解旋：由拓扑异构酶解除超螺旋； 识别起点：由DNA指导的引物酶完成； RNA引物合成： 以DNA为模板，在引物酶催化下由DNA转录生成5-10个核苷酸链；,DNA链延长：,在引物3-OH基上，按碱基互补原则经DNA聚合酶（主要是酶）催化DNA链 从53延伸。前导链为连续的；后滞链为不连续的冈崎片段。,由DNA聚合酶（主要是酶）催化，切去RNA引物；按碱基互补原则，沿53方向，补齐缺口。,切除引物，补齐缺口：,连接封口：,由DNA连接酶催化，将补齐缺口的3-OH基与下一个冈崎片段的5-P以磷酸二酯键连接起来（消耗NAD+），最终形成完整的、与模板互补的DNA新链。,校正并修复DNA：,由DN

12、A聚合酶校正并切除错配，再按53方向加上正确核苷酸。 至此，原核细胞DNA合成完毕。,如何决定DNA复制的准确性？,、DNA聚合酶具有模板依赖性，复制时dNTP按A-T、G-C碱基配对规律对号入座，使子代DNA与亲代DNA核苷酸顺序相同，但有大约10-4的错配。 、DNA聚合酶I、 、 均有35的外切酶活性，有纠正错配的校正作用，使错配减至10-6。 、再经错配修复机制，使错配减至10-9以下。,（四）真核细胞DNA的复制： （DNA指导的DNA合成）,真核生物与原核类似，但更复杂，不同之处： 1、DNA模板上有多个起点，即真核细胞 DNA复制由多个复制子共同完成。,2、有5种DNA聚合酶，

13、各具功能；,复制DNA： 后滞链； 前导链； 修复DNA： 、； 复制线粒体DNA： ； 引物合成：,在真核细胞内有五种DNA聚合酶 （与细菌DNA聚合酶的性质基本相同：底物、模板、引物、方向） 定位 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核 3-5 外切 - - + + + 酶活性 功能,引物 合成,修复 作用,线粒体DNA 的复制,核DNA 的复制,修复 作用,（五）反转录作用 ：（ RNA指导的DNA合成）,反转录（逆转录 revers transcription）： 以RNA为模板，4种dNTP为底物，合成与模板互补的DNA的过程。 这与通常转录过程中遗传信息从DNA到RNA的方向相反，

14、故称。 反转录酶： RNA指导的DNA聚合酶（RNA-directed DNA polymerase),催化逆转录反应的酶。,HIV的复制,反转录作用的生物学意义：,1）发展了中心法则；,2）有助于对RNA病毒致癌机理的了解； 3）有助于研究疾病的起因、寻找防治途径； 4）反转录病毒可改建成理想的信息载体，用于肿瘤和遗传病的基因治疗； 5）用于分子生物学的研究：合成基因、测序。,端粒(telomere),指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白 (human telomeras

15、e associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTRT),组成,功能,提供RNA模板 催化逆转录,端粒酶的催化延长作用,爬行模型,母链反折，有利于下游复制延伸,DNA聚合酶完成末端双链的复制,母链延长至一定长度后，端粒酶脱离母链，母链以其3-OH反折，同时起引物和模板的作用,（六）DNA的损伤与修复,概念： 1、 DNA的损伤： 一些理化因素：UV（紫外线）、电离辐射和化学诱变剂可使细胞DNA受到损伤而引起生物突变或致死。,UV造成的基因改变 嘧啶二聚体的形成,2、细胞的修复机制：,

16、1）光复活修复： 可见光激活了光复活酶，它能分开由于UV照射形成的嘧啶二聚体，而恢复原来状态。,2）暗修复(切除修复)：,在一系列酶作用下， 将DNA受损部分切 掉，并以完整链为模 板，合成被切部分， 从而使DNA恢复正 常。,3)重组修复,含有嘧啶二聚体或其他结构损伤的DNA在修复前仍可进行复制,但在新合成的子链中与模板损伤部位对应的地方因复制受阻而留下缺口.在重组酶的作用下,带缺口的DNA与完整的姐妹双链进行重组交换,用相应的DNA片断填补子链上的缺口.而在另一条亲链产生的缺口则由DNA聚合酶以与其互补的完整子链为模板进行修复合成,最后由连结酶将缺口封好.,（七）细菌的限制-修饰系统：,1

17、、限制性核酸内切酶（限制酶）： 特异性强，可在DNA特异位点切开； DNA杂交允许特异核酸序列被删除 ； 测序中可很快确定DNA序列。如：,2、细菌碱基修饰：,概念： 在DNA特定短碱基序列上产生某专一性修饰，在整个细胞周期中保持完整，使得内切酶可识别而不能断裂。 如：修饰甲基化酶。,意义：,可用以保护自身DNA，而外源DNA被分解； 被修饰的碱基可逃避宿主限制酶作用。 应用： 用于分子生物学研究：碱基测序、制定基因图谱的工具；用于基因重组。,利用限制酶进行基因重组,（八）基因重组与DNA“克隆”,1、基因重组： 将不同DNA片段按设计方案定向地连接起来，并在特定受体细胞中与载体一起复制表达，

18、使受体细胞得到新性状。,2、DNA克隆：,将目的DNA插入基因载体后，在细菌细胞中生长而扩增百万倍以上.这种以单一DNA片段复制成许多相同DNA片段的过程称。,二、RNA(ribonucleic acid)的生物合成,储存于DNA中的遗传信息需通过转录和翻译而得到表达。 转录的产物有： 信使RNA（messenger RNA, mRNA） 核糖体RNA（ribosome RNA, rRNA） 转移RNA（transfer RNA, tRNA）,转录方式,1.对称转录- DNA两条链都作为模板. 2.不对称转录- DNA一条链作为模板,另一条链不作为模板 3. 反向转录-以RNA作为模板合成DN

19、A,（一）转录（DNA指导下的RNA合成）,1、概述： 1）转录与DNA复制的相似之处： 均以DNA为模板； 都需依赖DNA的聚合酶； 都是生成3，5磷酸二酯键； 合成的方向都是5 3； 遵从碱基配对规律。,2）模板：,模板链 ： (大多数情况)DNA双链中只一条链可做转录模板(拷贝），此链称或有义链。 编码链： 无转录功能的DNA链称为或反义链。,转录的不对称：,即转录的可选择性。 包括： 一条链可转录，另一条链不能转录； 模板链可不在同一链上； 按细胞需要“开放或关闭”。,3） RNA聚合酶 （RNApolymerase, RNpol):,作用条件： 4种NTP； Mg2+或Mn 2+的存

20、在； DNA模板； 反应方向： 53,催化的反应：,不需引物,在单核苷酸的3-OH上逐个加核苷酸。,原核细胞的RNA聚合酶,4种亚基组成，各亚基功能不同； 同一种酶催化3种RNA的合成。,原核生物的RNApol全酶与DNA的结合,全酶：具有2亚基的RNApol。 核心酶：没有亚基的RNApol。,真核细胞的RNA聚合酶,3种酶，亚基复杂。,大肠杆菌的DNA聚合酶和RNA聚合酶有哪些重要的异同点？,DNA聚合酶和RNA聚合酶都能催化多核苷酸链向53方向的聚合。 二者不同点为： DNA聚合酶以双链为模板而RNA聚合酶只能以单链为模 板； DNA聚合酶以dNTP为底物，而RNA聚合酶以NTP为底物；

21、 DNA聚合酶具有35以及53的外切酶活性RNA聚合酶没有； DNA聚合酶可参与DNA的损伤修复而RNA聚合酶无此功能； 二者的结构也是不相同的。,4）转录产物结构特点：,5端和3端有不编码序列；,2、原核细胞的转录,包括：起始、延伸、终止,1）起始：,A、 启动子：DNA上的一段序列，为转录开始的位点。 包括： 上游的-35序列和-10(Pribnowbox)序列。 图中+1为DNA模板上被转录成RNA的第一个核苷酸 ， 即转录起始位点。,B、起始过程：,三步： A、全酶与启动子结合； B、DNA局部解开双螺旋；,C、形成磷酸二酯键。,RNA链从5端开始，在全酶作用下ATP或GTP与第2个N

22、TP间形成磷酸二酯键。,2）延伸：,a、合成开始后,亚基释放，然后都由核心酶催化。 b、核心酶沿模板移动，选择NTP，暂时形成DNA-RNA杂交链。,c、 RNpol向前移动，DNA解链酶向前推 进，RNA链延长。,d、方向：,RNpol沿模板链3 5,RNA合成方向5 3 。速度：25-50b/s。,3) 终止：,终止信号：富含GC的回文序列和随后一段富 含AT的结构。 RNpol到达终止位点，聚合反应停止。,A、不需因子的终止,a 、发夹结构的形成： DNA上的回文序列使RNA产物3 端自身碱基互补，形成发夹结构，杂合链趋于解体。 b 、产物的寡聚U片段促进RNA从DNA上脱落： 杂交链中

23、A- U间氢键相对较弱，新生RNA易从模板上脱落，不需因子即可终止。,回文结构DNA序列中以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同的双螺旋结构。即对称轴一侧的片段旋转180后，与另一侧片段对称重复。 回文结构能形成十字结构和发夹结构,不需因子的终止,b、需因子终止,因子是一个6聚体蛋白，其功能： 1）终止因子； 2）NTPase活性： 3）解旋酶活性。 过程： 1）在RNA存在下，水解NTP产能，使因子与 RNApol结合； 2）解旋酶活性使RNA：DNA杂合链拆开，释放RNA，酶和因子一起从DNA上脱落下来。,需因子终止,3、真核细胞的转录作用,1）特点； 其基因家族是多拷

24、贝的基因 重复组成，故一个基因上可同时进行多个转录过程，产生多条RNA链。 蛋白质编码基因多是不连续的，编码部分（外显子）被不编码基因（内含子）隔断。,多起点转录,南非爪蟾的卵母细胞rRNA的合成,2）转录过程：,A、起始： 启动子：具-25的TATA框（TATA box）； 有些无TATA框，以看家基因（housekeeping genes)起始转录。 转录因子(transcription factor ，TF)：由多种蛋白质组成，与启动子 装配成复合物，协助聚合酶结合，起始转录。,TF与启动子结合；各种TF辨认拼接；与RNpol结合，形成起始前复合物（ PIC ）。 顺序：TATA PIC

25、,起始过程：,D A B 酶/F E,B、延伸；,与原核类似： 以有义链为模板； RNApol催化RNA3-OH对新进入的NTP的磷酸基进行亲核攻击，RNA以5 3合成。 产物称原始转录产物,C、终止,转录终止与转录后修饰密切相关。,4、转录过程的抑制剂：,1）放线菌素D： 插入DNA的dG-dC间， 与G形成氢键，使 DNA变形、失去模板 功能，从而阻止RNpol 沿模板链移动而抑制 RNA延长。此为原核 和真核生物RNpol的 专一抑制剂。,放线菌素D,2）口丫啶acridine:,为具扁平芳香族发色团 的染料，可插入双链 DNA相邻bp间，使DNA 复制时缺失或增添一个 核苷酸，从而导致

26、移码 突变，也可抑制RNA的 起始和质粒DNA的复制。,3）利福平（利福霉素B的衍生物）：,与RNpol的 亚基结合，抑制原核细胞RNA的合成。,4）-鹅膏蕈碱：,分离自鬼笔鹅膏的一种八肽化合物，通过RNpol 抑制真核生物RNA合成。,5、转录产物的加工：,在专一酶作用下，切除多余部分或修饰，才成为“成熟的”RNA。此过程称为转录后加工。 涉及：帽化、 聚腺苷酸化、 RNA剪接、 碱基修饰等过程。,1）mRNA的加工：,原核生物的mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。亦有少数多顺反子的mRNA需要核酸酶切成小单位，然后再翻译。,多顺反子:为多条多肽链编码的mRNA. 单顺反子:为一条多肽链编码的mRNA.,真核mRNA的加工：,5-5磷酸二酯键,A、帽化；5端加上甲基化的鸟嘌呤帽。 意义： 免遭核酸酶水解；pr合成起始中发挥作用。,B、聚腺苷酸化：,过程：切去转录生成的过长的一段RNA； 由多聚腺苷酸聚合酶以ATP为前体，在3 端加上约100-200个腺苷酸尾巴(polyA)。 意义：免遭核酸酶水解； 增加翻译效率。,C、剪接：,即精确切除内含子序列的过程。 snRNA：富含u，部分序列与剪接点