《微生物生长》PPT课件.ppt

1、第 4 章 微生物的生长,微生物生长的概念 微生物生长量的测定 微生物的群体生长规律 环境因素对微生物生长的影响,内容提要,1.微生物的生长 一个微生物细胞在合适的外界环境条件下，不断地吸收营养物质，并按其自身的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其重量、体积、密度或浓度作指标来衡量。 微生物的生

2、长表现在微生物的个体生长与群体生长两个水平上。,4.1 微生物生长的概念,2.微生物个体生长 表现为个体质量和体积的增加。 3.微生物群体生长 以微生物细胞的数量或微生物群体细胞物质量的增加作为生长的指标。 个体生长个体繁殖群体生长 群体生长个体生长个体繁殖,4.1 微生物生长的概念,因而要了解微生物的生长规律，就要了解微生物的个体生长和群体生长两个方面。,4.1 微生物生长的概念,4.2 微生物生长量的测定,微生物特别是单细胞微生物，体积很小，个体生长很难测定，意义也不大。通常测定微生物的生长是测群体的生长，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。,4.2 微生物生长量的测定方法 可根据菌体细

3、胞量、菌体体积、重量直接测定，也可以根据某种细胞物质的含量或某个代谢活动速度间接测定。,微生物生长测量方法,个体计数法,重 量 法,生理指标法,一、测微生物总数 1、计数器直接计数,缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,2、电子计数器计数（略） 3、染色涂片计数 将已知体积的待测材料均匀涂布在载玻片的已知面积内，染色后显微镜下计数。一般1cm2 均匀涂片0.01ml样品。选择几个至十几个视野计数细胞数量。借助镜台测微尺测直径可计算出视野的直径： 每ml总数=

4、视野平均菌数1 cm2/视野面积100稀释倍数,涂片染色法,1视野菌液(ml)(0.01ml 1cm2)*视野面积(cm2),提问：数了125个小格中有90个细菌，样品中的细菌浓度是多少？ (90个125) * 400 / 0.1ml =2880个/ml 适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物 细菌个体若太小、过多，由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。,数数细菌（或其他微生物或细胞）数目，（一般数125个小格），折算样品细菌浓度；,5、比例计数法 将菌液与等体积血液混合后涂片，计算细菌数与红细胞比例。根据比例来计数,4、比浊法 测定菌数的快速方法。菌液中细胞浓度与浑浊度成正比，

5、因此测定悬液的光密度就可以反映细胞浓度。将未知细胞数的悬液与已知细胞数悬液相比来计数。,比浊计数法,浊细菌悬浮液的浊度,细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成正比,以生物量为指标测定微生物的生长,比浊法,在一定波长下，测定菌悬液的光密 度，以光密度(optical density, 即O.D.) 表示菌量。,实验测量时应控制在菌浓度与光密度 成正比的线性范围内，否则不准确。,5.比浊法,（二） 测定活菌数,1、液体稀释培养基计数： 将待测样品作连续10倍稀释，一直稀释到稀释液的少量接种到新鲜培养基中没有或极少生长。记录每个稀释度出现生长的试管数，再用最大或然率理论，查MPN（mos

6、t probable number，最大可能数量）表，根据样品的稀释倍数就可计算出其中的活菌含量。,无菌水,稀释平板计数法固体培养法,第一步：菌样巧妙稀释,得到不同稀释度 （10-x）菌液,菌样被无菌水不同稀释倍率后平板培养图,各取1ml，均匀涂布于冷固体培养基平板上或与温热液态固体培养基混合冷却。,第三步：培养,稀释度过低，菌落密集无法计数,可以计数，但数量过多，费时费力,数量合适，统计计算，作为结果,数量太少，误差因素太大，不做计数,第二步：接种平板,每一个细菌会生成一个菌落,一般计数平板的细菌生长菌落数以30300个为宜。,第四步： 计数,细菌数量=？ 细菌数量=数出的菌落数/稀释度 例

7、如：10-5稀释度时菌落数为125个 细菌数量=125/10-5=1.25107个/mL 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法 如国标法水中细菌总数的测定 。 注意：作空白及取平行样（23组）均值减小误差,平均,稀释液体计数法,特点：液体培养、统计学查表计数 又称MPN法 （或最可能数法） Most Probable Number 例如测定SRB（硫酸盐还原菌，厌氧）的数量 提问：能用稀释平板法计数吗？为什么？ 一般不能，厌氧菌暴露在空气中不能生长（除非厌氧培养箱）,对这类菌可以利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征进行深层隔氧液体培养，按MPN法进行计数。,（1）稀释,（2）稀释接种样品,在液

8、体表面加一层无菌液体石蜡隔绝氧气，,恒温37培养14天,记录变黑的试管情况,（3）培养,1ml,+ 9ml,培养基,提问：为什么有些试管变黑有些没有？,稀释程度、取样概率,The most probable number method（液体稀释法）,主要适用于只能进行液体培养的微生 物，或采用液体鉴别培养基进行直接 鉴定并计数的微生物。,对未知样品进行十倍稀释，然后根据估算取三个连续的稀释度 平行接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况进行统 计，长菌的为阳性，未长菌的为阴性，然后根据数学统计计算 出样品中的微生物数目。,比例计数法,比例样品菌液与等体积的血液混合，观测二者比例,提问：如果

9、平均每个视野中细菌数量/红血球的数量比例为5.5：1，则细菌数量=？ 5.5400万个/m l =2.2107个/mL样品,红血球数已知(男性400500万个ml，女性350450万个ml)，平均400万个/ml,2、薄膜计数法：如果测定量大而含菌浓度很低的样品（如空气、水）中的活菌数，可将样品用微孔薄膜（硝化纤维素薄膜）过滤，再与膜一起放到培养基或浸透培养液支持物表面培养。,膜过滤培养法,当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样 品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形 成的菌落进行统计。,以数量变化对微生物生长情况进行测定,3、菌落计数（平板菌落）计数法

10、,统计查表计算,根据不同稀释度变黑试管 统计出数量指标 三位数及其中最低稀释度 （取变黑的管数最多、稀释度又最低的生长管数，为第一位数字，后面两个稀释度的生长管数后两位数）,查表 表MPN表,（三） 计算生长量：测细菌重量,（1） 测细胞干重：一般干重为湿重的20-25%。收集单位体积培养液中菌体，干燥器内加热或减压干燥，直接用仪器测定。,（2） 测细胞含N量确定细胞浓度： 凯氏定氮法测N，总蛋白含量=含N量%6.25,（3） 通过DNA测定计算浓度： 荧光法，每个菌平均含DNA 8.410-5ng,（4） 生理指标： 测定微生物对氧的吸收、发酵糖产酸量或二氧化碳产量。,二、研究微生物生长的方

11、法 微生物生长分个体生长和群体生长。培养方法有分批培养和连续培养。,4.3.1 分批培养 分批培养是在一个封闭的、有一定体积的液体培养基的容器中接种少量细菌在特定条件下进行培养。在分批培养中微生物只完成一次生长循环。 细菌的生长曲线：将少量细菌接种到一定体积的新鲜液体培养基中进行分批培养，定时取样，以细菌数目的对数为纵坐标，培养时间为横坐标，可绘制出细菌的生长曲线。,停滞期,生长曲线可分：,对数期,静止期,衰亡期,1、停滞期（迟滞期或适应期）（lag phase）: 将细菌接种到某一培养基后，细菌并不立即繁殖而是经过一段适应期才能生长繁殖。调整适应表现在合成多种酶、完善体内的酶系统及其他细胞成

12、分。,特点： （1）细胞质均匀 （2）代谢活力强 （3）蛋白质和RNA含量增加 （4）体积显著增加，许多杆菌可长成长丝状 （5）形成诱导酶的能力强 （6）对环境变化敏感,影响因素： （1）接种量。接种量大，停滞期可缩短 （2）菌龄。菌种年轻，对数生长期接种，停滞期可能很短甚至不明显,（3）营养。如果种子培养基与新接种的培养基成分相同，则对菌生长有利。从丰富培养基转入贫营养基，停滞时间拉长，反之减少； （4）菌种特性。大肠杆菌停滞期长，分枝杆菌长,2、对数期（指数期）log phase 细菌生长速度达到最大，数量以几何级数增加。,特点： （1）细菌迅速分裂，菌数按几何级数增加； （2）世代时间最

13、短，而且恒定； （3）生长速度最高而且恒定； （4）代谢活力强无死亡； （5）菌体整齐，体积恢复到原来大小； （6）对环境敏感，生理性状及菌体成分较一致,世代时间的计算：,x2=x12n,以对数表示：lgx2=lgx1+nlg2,生长速率常数,平均世代时间,世代：由1个细胞分裂成为2个细胞的间隔被称为世代。 代时：就是一个世代所需的时间，因而也就是群体细胞数目扩大1倍所需的时间，有时也被称为倍增时间。,影响因素： （1）温度。在适温范围内，每增加10，生长速度提高1倍；,（2）营养；营养越丰富，代时越短 （3）氧气。好氧菌若能供给充足的氧，可能使对数期延长。,对数期的实践意义 是代谢、生理研究

14、的良好材料 是增殖噬菌体的最适宿主菌龄 是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄 G+染色鉴定时采用此期微生物,3、稳定期（stationary phase） 由于营养消耗，供应不足及代谢产物的积累，这时一部分菌死亡，细菌进入稳定期。,稳定期到来的原因主要是： 营养物尤其是生长限制因子的耗尽； 营养物的比例失调，例如CN比值不合适等； 酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积； pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。,特点： （1）菌数达到最高峰； （2）活菌数达到动态平衡； （3）生长速率为零； （4）开始积累贮存物质,影响因素： （1）前期主要是营养，补充营养可延长静止期； （2）后期主要是

15、代谢产物的积累； （3）离子、pH等物化条件失去平衡,4、衰亡期 decline phase 由于营养缺乏和代谢产物积累造成自身中毒，细胞生长受阻，时间和菌数对数呈反比，生长曲线直线下降。 特点： （1）生长速率为负值，活菌数减少； （2）细菌发生自溶现象autolysis （3）代谢产物大量积累； （4）形态多变，出现畸形或衰退形。,4.3.2 连续培养 原理：如果在培养器中不断补充新鲜营养物质并及时不断地以同样速度排出培养物，理论上讲，对数生长期可以无限延长。,1、恒浊连续培养 不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定的培养方法。根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速

16、，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞 。,恒浊连续培养可以不断提供具有一定生理状态的细胞，可以得到以最高生长速率进行生长的培养物，在微生物工业上运用此法可得到大量菌体及相应的代谢产物如乳酸、乙醇。,2、恒化连续培养 维持进水中的营养成分恒定，从而保持细菌的恒定生长速率称恒化连续培养，也称恒组成连续培养。 恒化连续培养基中，某种必须的营养物质必须在低浓度作为限制性因子，其他成分过量。这样，细菌的生长速率取决于限制性因子的浓度。 常用的限制性营养物质有作为N源的氨、氨基酸；作为C源的葡萄糖、麦芽糖、乳酸；生长因子、无机盐等。,稀释度（率）：新鲜培养基流入的速度为f，培养器中培养液体积为V，

17、稀释度为D=f/V，表示单位时间内，新加入的培养基体积与培养器内培养基总体积之比。 随着D增大，细菌浓度先升后降，但在相当大范围内这种变化不明显。当稀释度增大到最大比生长速率时，微生物的增长速率赶不上流出速率，结果必然是到某一时刻，微生物浓度降到维持生长所必需的最低浓度（临界浓度）之下，这时培养器内微生物浓度趋于零。这时的D为临界稀释度。,同步生长：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长（synchronous growth） ，进行同步分裂的细胞称为同步细胞。 同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学

18、等研究的良好材料。,4.3.3同步生长（synchronous growth）,同步培养技术（synchronous culture）：设法使群体中的所有细胞尽量都处于同样的细胞生长和分裂周期中。 同步培养法：能获得处于同一生长阶段的群体细胞的培养方法,获得同步生长的方法：,获得同步生长的方法主要有两类： 环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。 机械法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。,4.4.1温度对微生物生长的影响 温度是影响微生物生长的最重要因素之一。 温度对微生物的影响具体表现在： 影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最

19、终影响细胞合成。 影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。 影响蛋白质、核酸等大分子物质。,4.4 环境因素对微生物生长的影响,从微生物整体来看:生长的温度范围一般在-10 100 极端下限为-30 ，极端上限为105300 但对于特定的某一种微生物： 只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有自己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度,处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。 超过最低生长温度时，微生物不生长，温度过低，甚至会死亡。 超过最高生长温度时，微生物不生长，温

20、度过高，甚至会死亡。,（1）微生物生长的三个温度基点,微生物类型,生长温度,最低 最适 最高,嗜冷微生物 兼性嗜冷微生物 嗜温微生物 嗜热微生物 超嗜热或嗜高温微生物,45 45 5565 80 65 8090 100,根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为五个类型,高温对微生物的影响 高温下蛋白质不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构（溶菌）。 低温对微生物的影响 当环境温度低于微生物的最适生长温度时，微生物的生长繁殖停止，当微生物的原生质结构并未破坏时，不会很快造成死亡并能在较长时间内保持活力，当温度提高时，可以恢复正常的生命活动。 低温保藏菌种就是利用这个原理。一些细菌、酵母菌

21、和霉菌的琼脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在4的冰箱中。 当温度过低，造成微生物细胞冻结时，有的微生物会死亡，有些则并不死亡。,（2）高温与低温对微生物的影响,造成死亡的原因： 冻结时细胞水分变成冰晶，冰晶对细胞膜产生机械损伤，膜内物质外漏。 冻结过程造成细胞脱水。,2.氧气对微生物生长的影响 微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群: 好氧菌:专性好氧菌;微好氧菌 兼性厌氧菌:耐氧厌氧菌： 厌氧菌:(专性)厌氧菌,专性好氧菌（strict aerobe）,必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化

22、酶（SOD，superoxide dismutase）和过氧化氢酶。,在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；细胞含有SOD和过氧化氢酶。,微好氧菌（microaerophilic bacteria）,只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能,兼性好氧菌（facultative aerobe）,耐氧菌（aerotolerant anaerobe）,可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。,厌氧菌

23、（anaerobe）,分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气或含有10%CO2的空气中，在固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。,影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力。 改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径：如：酵母菌在pH4.5-5产乙醇，在 pH6.5以上产甘油、酸。 环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质吸收，或有毒物质的毒性。,3.pH值对微生物生长的影响,

24、微生物的生长pH值范围极广，从pH28都有微生物能生长。但是绝大多数种类都生活在pH5.09.0之间。 微生物生长的pH值三基点： 各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。 不同的微生物最适生长的pH值不同，根据微生物生长的最适pH值，将微生物分为： 嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌 耐碱微生物：许多链霉菌 中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌 嗜酸微生物：硫杆菌属 耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌,不同微生物对pH要求不同,4.5 微生物生长繁殖的控制,几个基本概念,灭菌（sterilization）采用强烈的理化

25、因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，实质上可分杀菌（bacteriocidation）和溶菌（bacterioly-sis）两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后，其细胞发生溶化、消失的现象。,消毒（disinfection）是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。,防腐（antisepsis）是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。,化疗（chemotherapy）即化学治疗。利用具有高度选择毒力（对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物

26、质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。,4.5.1控制微生物的化学物质,抗微生物剂,抗代谢物,抗生素,酸和碱：医院病房常用乙酸消毒。,重金属极其盐类：升汞,有机化合物 ：醇、醛、酚是常用的杀菌剂。,氧化剂：高锰酸钾、双氧水等,卤素：氯，碘是常用的消毒剂,染色剂,表面活性剂,抗微生物剂(antimicrobial agent),杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质,抗代谢物(antimetabolite),有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相 似，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功 能。干扰代谢的正常代谢。这些物质称为抗代谢物。,叶酸 磺胺类药物,嘌

27、呤 6巯基嘌呤,氨基酸 5甲基色氨酸,吡哆醇 异烟肼,每种抗生素都有一定的杀菌范围，称为抗菌谱。,抗生素(antibiotic),是由微生物在代谢过程中产生（有的可人工合成）具有一定浓度下抑制或杀死其他微生物的有机化合物。,抑制细胞壁的形成,干扰蛋白质合成,抑制核酸复制,影响细胞膜的功能,高温灭菌,辐射作用,过滤作用,高渗作用,超声波,4.5.2 控制微生物的物理因素,1.高温灭菌（消毒）法是最常用的物理方法。高温可引起蛋白质、核酸等活性大分子氧化或变性失活而导致微生物死亡。,煮沸消毒法 将水加热至100，煮沸15min30min，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒物的目的。 巴斯德消毒法（Pa