讲课—血红蛋白的提取和分离课件.ppt

1、课题3 血红蛋白的提取和分离,课标领航 1概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理。 2能根据凝胶色谱过程中的现象和结果，评价实验操作的过程是否规范，分析实验结果。 3尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，体验从复杂的体系中提取生物大分子的基本过程和方法。 【重点】凝胶色谱法、电泳法基本原理。 【难点】实验操作的过程及分析。,基础自主梳理,一、凝胶色谱法 1概念：也称作分配色谱法，是根据_质量的大小分离蛋白质的有效方法。 2原理 (1)由微小的多孔球体构成的凝胶，内部有许多贯穿的通道。,相对分子,蛋白质的物理性质：分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等,

2、(2)由相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量_的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在_移动，路程较短，移动速度较快，从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以分离。,较小,凝胶外部,蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析,2配制：由12种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的_就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。 三、电泳 1概念：指_在电场的作用下发生迁移的过程。 2原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷_的电极移动。,使用比例,

3、带电粒子,相反,二、缓冲溶液 1作用：在一定范围内，抵制外界的_对溶液pH的影响，维持pH基本不变。,酸和碱,3作用：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身的大小、_的不同，使带电分子产生不同的_，从而实现样品中各种分子的分离。 4方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。,形状,迁移速度,四、,四、实验操作 1样品处理：通过_、_、分离血红蛋白溶液等操作收集血红蛋白溶液。 (1)红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。分离时采取低速短时间离心，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。 (2)血红蛋白的释放：在蒸馏水和_的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。,(3)

4、分离血红蛋白溶液：把搅拌好的混合液离心后, 分为四层：1.无色透明的甲苯层2.白色薄层固体(脂类物质)3.红色透明液体(血红蛋白的水溶液)4.其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的红色透明液体。,甲苯,血红蛋白的释放,红细胞的洗涤,2粗分离：即透析 (1)方法：将血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋放入一定量适宜浓度的_中，透析12 h. (2)目的：将样品中分子较小的杂质除去。 (3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。,磷酸缓冲液,3纯化：通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下： (1)凝

5、胶色谱柱的制作。 (2)凝胶色谱柱的装填 材料：本实验使用的是交联葡聚糖凝胶。 方法：凝胶用_充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有_存在；不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象。 (3)样品的加入和洗脱 a.准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与_平齐，关闭出口。,蒸馏水,气泡,凝胶面,b加样：用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。 c加样后：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内. 洗脱：加入_，打开下端出口，进行洗脱。 4纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 五、操作提示 1红细胞的洗涤：洗涤

6、次数、_与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白：离心速度过高和时间过长会使_等一同沉淀，达不到分离效果。,磷酸缓冲液,离心速度,白细胞,2色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用_加热，加速膨胀。 3凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 4蛋白质的分离：如果红色区带_地移动，说明色谱柱制作成功。,沸水浴,均匀一致,血红蛋白的提取和分离,蛋白质的提取和分离一般分四步： 样品处理粗分离纯化纯度鉴定。 1样品处理,(1)红细胞的洗涤 采集血样低速短时间离心吸取血浆生理盐水洗涤低速离心重

7、复步骤三次。 特别提醒 (1)洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的进行。 (2)离心时转速要低，时间要短，一般为500 r/min，离心2 min。 (3)洗涤三次后，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数。,重点回顾：,特别提醒 (1)将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层。 (2)将滤液于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的血红蛋白水溶液层。,(4)透析 取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。目的是除去样品中相对分子质量较小的杂质。,2凝胶色谱操作 (1)凝胶色谱柱的制作 取长4

8、0 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。 顶塞的制作：打孔安装玻璃管。 组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 安装其他附属结构。,特别提醒 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。,(2)凝胶色谱柱的装填(本实验使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶) 固定：将色谱柱垂直固定在支架上 装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内 洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h,(3)样品的加入和洗脱 调整缓冲液面：与凝胶面平齐 滴加透析样品：用量为1 m

9、L 样品渗入凝胶床：样品完全渗进凝胶层 洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱 收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集,特别提醒 (1)滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 (2)在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功。,谢谢大家,有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是() A它们都是分离蛋白质的重要方法 B它们的原理相同 C使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要 D以上说法都正确,A,下列各项中，一般不影响凝胶色谱法分离蛋白质的分离度的是() A层析柱的高度 B层析柱的直径 C缓冲溶液 D样品的分布,B,下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入(图)和洗脱(图)示意图，请据图回答下列问题。,(1)在加样示意图中，正确的加样顺序是_。 (2)用吸管加样时，应注意正确操作，分别是_、贴着管壁加样、 。 (3)等样品 时，才加入缓冲液，待_接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每_mL收集一管，连续收集。,不要破坏凝胶面,使吸管管口沿管壁环绕移动,完全进入凝胶层,红色的蛋白质,5,【互动探究】(1)凝胶色谱柱的装