chap08 蛋白质的提取.ppt

1、第8章 蛋白质的提取,8.1 原材料的选择原则 8.2 细胞破碎和细胞器的分离 8.3 提取时有生理活性物质的保护措施 8.4 提取条件的优化 8.5 蛋白质提取的原则,主要内容,8.1 原材料的选择原则,微生物 植物和动物都可作为制备生物大分子的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。,对于微生物，应注意它的生长期，如在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量。,以微生物为材料时有两种情况：利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。,植物材料必须经过去壳、脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变

2、化很大，另外与季节性关系密切。,对动物组织，要选择有效成分含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。,近年来,由于基因工程的出现,采用微生物作为分离材料的情况越来越多了,例如细菌,酵母细胞等.,对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。,8.2 细胞破碎和细胞器的分离,破碎细胞释放细胞内容物的方法很多。根据作用方式不同，基本可以分为两大类：机械法和非机械法。传统的机械法包括匀浆、研磨、压榨、超声等；常见的非机械法包括渗透、酶溶、冻融、化学等；其中一些新的方法也在不断发展和完善，如激光破碎、冷冻喷射、相向流撞击等。,每一种方法都有它的适用

3、范围及优缺点，选择的标准常常要依靠过去经验和实践比较。选择的原则是该方法不影响目的蛋白或产物的结构和功能，或者说，采用的方法可以避免造成目的蛋白或产物的变性或失活。,常见组织和细胞的破碎和溶解一般都采用传统的标准方法，有时为了增加活性蛋白的回收率或针对产物蛋白的特性尝试或筛选细胞破碎和溶解的方法也很有必要。,细胞破碎前，组织一般用缓冲液洗去残留血液和污染物；培养细胞通常用缓冲液混悬后离心，除去残留培养液等。细胞破碎获得的抽提物称为匀浆。,匀浆根据不同需要可以在12000g10min到100000g 1h范围内离心。沉淀主要含有膜组分等，应弃去。上清含有目的蛋白称为粗提物。如果粗提物有漂浮颗粒，

4、可用纱布或玻璃纤维滤去后再进一步纯化。,匀浆法,匀浆是机体软组织破碎最常用的方法之一。它的工作原理是通过固体剪切力破碎组织和细胞，释放蛋白进入溶液。市售的匀浆器主要有四类，刀片式组织破碎匀浆器、内切式组织匀浆器、玻璃匀浆器和用于规模生产的高压匀浆器。玻璃匀浆器的匀浆杵有玻璃制的，也有特夫隆制的，既可以手动也可以电动。,由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，所以匀浆是简便、迅速和风险小的组织破碎方法，是实验室首先考虑的方法之一。,匀浆过程应注意维持低温。玻璃匀浆器可外置冰水浴，其他匀浆容器可预冷或在冷室内匀浆。匀浆时所需匀浆缓冲液的体积在不同条件下可有很大差别，有时甚至可为湿重组织体积的

5、9-10倍。,该匀浆器由一根一端表面磨砂的玻璃杵和一个内壁磨砂的玻璃管组成。使用时，先用锋利的刀片把组织切成碎块，然后把组织碎块或细胞悬液加入套管后，手工或以电动搅拌机旋转研磨，玻璃杆在套管中上下移动时产生机械切力使细胞破碎。这种方法对生物大分子破坏少，是目前广泛使用的一种细胞破碎方法。,(1)杵状玻璃匀浆器法,匀浆器由调速器、支架、马达、带杆叶片刀和梅花玻璃杯组成。使用时先将4预冷的组织碎块或细胞悬液加入玻璃杯中，至杯体积的1/3即可，盖好玻璃杯盖，固定好带杆叶片刀，缓缓调节旋转速度。一般开机数十秒后，组织细胞即可被高速旋转的叶片刀破碎。组织捣碎机高速转动时易产热可导致分离物的降解，因此注意

6、不能持续时间过久，必要时使用循环冷却水降温。,(2)高速组织匀浆器法,超声波法,输入高能超声波可以破碎细胞，其机理可能与强声波作用溶液时，气泡产生、长大和破碎的空化现象有关。空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞裂解。超声破碎的效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等。,使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。因为产生泡沫会导致蛋白质变性。过低的强度将降低破碎效率。最好在正式实验前用多余的样品进行试验。,超声破碎在处理少量样品时操作简便，液量损失少，此法多适用于微生物材料和脑组织匀浆。,此法的缺点是超声波产生的化学自由基能使敏感的活性物质变性失活，噪声

7、令人难以忍受，大容量装置声能传递、散热均有困难，在处理过程中会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感的酶和核酸应慎用。,高压匀浆法,细胞悬液从高压室的环状隙高速喷射到静止的撞击环上，被迫改变方向经出口管流出。此过程中细胞经历了高速造成的剪切、碰撞及高压到常压的变化，从而破碎释放内含物。,增加压力或增加破碎次数都能提高破碎效率，但压力增加到一定程度零部件磨损较大。为防止污染，使用前后高压室至出口管需彻底清洁。 该法常用来裂解细菌和酵母。适用于中等体积(10-30 ml)的样品，体积太大或太小均不适宜。,研磨法,研磨是破碎单一细胞的有效措施。借助研磨中磨料和细胞间的剪切及碰撞作用破碎细胞。

8、常用的磨料为沙子、氧化铝。在研钵内样品与磨料被研磨成厚糊状。一次破碎的细胞量湿重可达30g.,此法主要用于细菌、酵母和一些植物组织。研磨操作一般不超过15 min。石英沙或氧化铝用前做清洁处理。,高速珠磨法,该法应视为研磨法的扩展。它用玻璃珠替代磨料。小量样品(湿重不超过3g)可在试管内进行，大量样品需使用特制的高速珠磨机.,本法最常用来破碎酵母。,酶溶法,常用的有溶菌酶、-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶、糖苷酶、肽链内切酶、壳多糖酶等。细菌主要用溶菌酶处理，酵母需用几种酶进行复合处理。使用溶酶系统时要注意控制温度、酸碱度、酶用量、先后次序及时间。,酶溶法就是用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。

9、因此利用此方法处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶。,虽然酶溶法有选择性释放产物、核酸泄出量少、细胞外形完整等优点，但它也存在明显不足，如酶价格高、通用性差、有时存在产物抑制。,化学渗透法,有些有机溶剂(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂(SDS、NP-40、TritonX-100等)、金属螯合剂(EDTA)、变性剂(盐酸胍、脲)等化学药品都可以改变细胞壁或细胞膜的通透性，使内含物有选择地渗透出来。,此法主要用于溶解培养的动物细胞。低浓度表面活性剂处理，如能充分溶解细胞，则它是很温和的方法。若目的蛋白不稳定，冰浴中孵育时间可以减少甚至取消；裂解液中加入甘油也可以稳定目的蛋白。,反复冻

10、融法,将细胞在-20以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。,它仅适用于提取非常稳定的蛋白。对于韧性很强的组织如皮肤、肌腱等，可用液氮冻硬变脆，敲碎成小块后，在研钵中加液氮研成粉再加缓冲液溶解。,低渗裂解法,此法是无细胞壁细胞在低渗溶液中通过渗透张力作用裂解的方法，常用于红细胞的裂解。,小结,无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子物质降解，导致天然物质量的减少。,加入二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物(

11、PMSF)能消除蛋白水解酶活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。,各种组织细胞破碎方法,细胞器的分离,细胞器的分离，一般采用差速离心法或密度梯度离心法。这是利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得到所需组分。,细胞器分离中常用的介质有蔗糖、Ficoll或葡萄糖等高分子溶液。,8.3 提取时有生理活性物质的保护措施,对于一些具有生理活性的物质的提取，除了考虑所选用的溶剂对被提取物有较大的溶解度，对杂质有较少的溶解度外，还应综合考虑提取所用的溶剂中各种成份的组合及其他因素，使这些活性物质在提取时处于稳定状态。,对于一些生物大

12、分子如蛋白质、酶和核酸来说,主要措施有如下几点：,1 采用缓冲系统 防止提取过程中某些酸碱基团的解离，造成溶液中pH值变化幅度过大，导致某些活性物质的变性，或由于pH影响提取的效果。,2 加入保护剂 防止某些生理活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏。如最常见的巯基，是许多活性物质和酶催化的活性基团，它极易被氧化，故提取时常加入一些还原剂如半胱氨酸，巯基乙醇，二巯基赤藓糖醇，还原型谷胱甘肽等以防止它的氧化。,其他的措施如提取某些酶常加入一些底物。一些易受重金属离子抑制生理活性的物质，加入某些金属螯合剂，把有害金属离子螯合掉，而保持被提取的活性物质的稳定性。,3 抑制水解酶的破坏 是提取生化物

13、质中最重要保护性措施之一。,无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少。,可根据不同水解酶的性质采用不同方法，如需要金属离子激活的水解酶(如DNase)，常加入EDTA或用柠檬酸缓冲液除去溶液中的某些金属离子，使酶的活动受到抑制。,对热不稳定的水解酶，可用热提取法使之失去作用，或根据水解酶的溶解性质的不同，采用不同pH值提取以减少水解酶释放到提取液中的机会；或选用pH范围使酶活力最低。,但最有效方法还是针对性地加入某些抑制剂，以抑制水解酶的活性。,加入二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性

14、中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部。,但这些抑制剂在抑制蛋白水解酶的同时，也常抑制其他蛋白质和酶的活性，使用时必须小心选择。一般说，提取蛋白质时，加入蛋白水解酶的抑制剂没有象使用核酸酶抑制剂在核酸提取时那样普遍和迫切。,4 其他一些特殊要求的保护措施，除前面已提及过种种引起生物大分子变性因素，如紫外光、强烈搅拌、过酸过碱、高温、冻结等均避免外。某些生物大分子提取时的特殊要求，如固氮酶钼-铁蛋白，提取分离时严格要求无氧条件下进行，以及某些对冷或热敏感的蛋白要求一定的温度下操作等均应根据不同具体对象予以不同处理。,8.4 提取条件的优

15、化,有关缓冲液、盐、金属离子、螯合剂、还原剂、去垢剂、以及蛋白酶的抑制剂等的选择问题，请参见蛋白质技术一书。,蛋白质技术手册，汪家政,范明，科学出版社，,9.5 蛋白质提取的原则,大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。,水溶液提取法,稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此温度高利于溶解，缩短提取时间

16、。但温度升高会使蛋白质变性失活，因此提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂。,提取液pH值和盐浓度的选择,pH值 蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。,盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐(一般为0

17、.15M)。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。,有机溶剂提取法,一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。,但必须在低温下操作，丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。,蛋白质的分离纯化,蛋白质的分离纯化方法很多,主要有： (1) 根据蛋白

18、质溶解度不同分离 (2) 根据蛋白质分子大小的差别分离 (3) 根据蛋白质带电性质进行分离 (4) 根据配体特异性的分离方法亲和层析法等。,根据蛋白质溶解度不同的分离方法,a 盐析 b 等电点沉淀法 c 低温有机溶剂沉淀法,a 蛋白质的盐析,中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度有不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。,将大量盐加到蛋白质溶液中时，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。,盐析时若溶液pH在蛋白质等

19、电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。,1温度：除对温度敏感的蛋白质在低温操作外,一般可在室温中进行.一般低温时，蛋白质溶解度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25)比0时溶解度低，更容易盐析。,影响盐析的因素,2 pH值 大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低。,3 蛋白质浓度 蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来(共沉)。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。,蛋白质盐析常用的中性盐，主要

20、有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。,其中应用最多的是硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大(25时为767克/升(4.1M),0时为676克/升(3.9M)，在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；,另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。,蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内，用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。,此外也可用葡聚糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用

21、的时间就比较短。,蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。,等电点沉淀法,用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。,低温有机溶剂沉淀法,根据蛋白质分子大小的差别的分离方法,透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。,超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的滤膜截留不同分子量的蛋白质。,也称分子排阻层析

22、或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡聚糖凝胶(Sephadex gel)和琼脂糖凝胶(agarose gel)。,凝胶过滤法,凝胶过滤法,根据蛋白质带电性质进行分离,蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。,各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。,电泳法,值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。,离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素