1.2基因工程的基本操作程序.ppt

1、1.三种工具是？ 2.两种末端类型？ 3.根据DNA连接酶的来源，将其分为哪两类？ 4.运输车的种类？,1.2基因工程的基本操作程序,基因工程的基本操作程序,1.目的基因的获取,2.基因表达载体的构建,3.将目的基因导入受体细胞,4.目的基因的检测与鉴定,目的基因主要是指_,一、目的基因的获取,编码蛋白质的基因,与生物抗逆性相关的基因（如抗虫基因） 与优良品质相关的基因(如富含赖氨酸的蛋白质编码基因) 与生物药物保健品相关的基因（如胰岛素基因） 与毒物降解相关的基因（如分解石油中烃的基因） 与工业所用酶相关的基因（淀粉酶基因）,目的基因主要是指_,一、目的基因的获取,编码蛋白质的基因,目的基因

2、还可以是_,具有调控作用的因子,一、目的基因的获取,1.从基因文库中获取,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,基因文库：,含有一种生物的全部基因,含有一种生物的部分基因,基因组文库,目的基因的mRNA,杂交双链 (单链RNA/单链DNA),单链DNA,反转录酶,核酸酶H,DNA聚合酶,双链DNA (目的基因),CDNA文库 （部分基因文库）,两种基因文库除了基因的种类、数量，还有什么区别？,目的基因的mRNA,杂交双链 (单链RNA/单链DNA),单链DNA,反转录酶,核酸酶H,DNA聚合酶,双链DNA (目的基因

3、),基因,DNA,基因,基因,基因的结构,原核细胞的基因,编码区,非编码区,编码区的上游和下游,转录为相应的mRNA，指导蛋白质的合成。即能够编码蛋白质。,（编码序列）,不能指导蛋白质的合成，但能调控遗传信息表达。,上游：启动子 下游：终止子,原核细胞与真核细胞基因结构的比较,相同点,不同点,由编码区和非编码区组成。,编码区是间隔的、不连续的。,外显子：能够编码蛋白质的序列； 内含子：不能编码蛋白质的序列。,思考1.反转录法得到的目的基因中有非编码区吗？有内含子吗？ 思考2.在发育某一段能得到某生物所有基因对应的RNA吗？ 思考3.真核生物基因组文库中获取的DNA转入原核生物细胞中能正常表达吗

4、？,目的基因的mRNA,杂交双链 (单链RNA/单链DNA),单链DNA,反转录酶,核酸酶H,DNA聚合酶,双链DNA (目的基因),基因组文库和CDNA文库的区别,依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性,从基因文库中获取目的基因,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,（二）利用PCR技术扩增目的基因,PCR全称为 。,是一项在生物 复制 的核酸合成技术,变性：加热至9095双链DNA解链成为单链 退火（复性）：冷却至5560，引物与单链相应互补序列结合 延伸：加热至7075，在DNA聚合酶作用下

5、延伸，合成互补的新DNA,条件：_、 _、_ (启动作用)、 _,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,DNA复制,目的基因，并有一段核苷酸序列已知,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,（二）利用PCR技术扩增目的基因,过程1.目的基因受热变性，解链（高温变性） 过程2.引物与单链互补结合（退火）复性（低温复性） 过程3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸（中温延伸） 过程4.多次重复,PCR扩增仪,（二）利用PCR技术扩增目的基因,利用PCR技术扩增目的基因,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板

6、在热作用下， 断裂，形成_,b、复性（55-60）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,（三）DNA合成仪用化学方法直接人工合成,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,条件：已知序列的较小基因,推出的基因碱基序列唯一吗？,如：,获取目的基因时一定要构建基因文库？,如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，

7、不一定要构建基因文库。,寻根问底：将所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多。,基因工程的核心,二、基因表达载体的构建,1、基因表达载体的作用,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,二、基因表达载体的构建,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,（1） 生物之间进行基因交流，只有

8、使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子、终止子，只将编码序列导入受体生物中无法正常转录。 （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记。,2.基因表达载体的组成：,目的基因+启动子+终止子+标记基因+复制原点,它们各自的作用是什么?,启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。,终止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA片段，使转录在所需要的地方停止下来。,标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。如抗生素抗性基因。,质粒,DNA分子,限制

9、酶处理,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,一般同一种,表达载体的构建是千篇一律的吗？,3.基因表达载体的构建过程,转化 ,方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞吸收,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,三、将目的基因导入受体细胞,1、将目的基因导入植物细胞,农杆菌特点,能感染双子叶植物和祼子植物，对单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,农杆菌转化法,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利

10、用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。单子叶植物常用。,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,2、将目的基因导入动物细胞,显微注射技术,提纯含目的基因表达载体,取（受精）卵,显微注射,胚胎早期培养后移植到输卵管或子宫,新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：Ca2+处理,常用菌：大肠杆菌,原核细胞作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,

11、Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,检测,鉴定：,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,四、目的基因的检测与鉴定,个

12、体水平的鉴定,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,首先取出转基因生物的基因组DNA 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记，以此做探针 使探针和转基因生物的基因组杂交，若显示出杂交带，表明染色体已插入染色体DNA中,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,DNA,附着在膜上,硝酸纤维素,加探针,基因探针（含荧光素分子）,变性,DNA杂交 （如检测病毒等）,a,b,c,d,漂洗后放射自显影,（二）鉴定（个体生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分 子 杂 交,方法:,抗原抗体杂交

13、,过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交，若出现杂交带，表明目的基因转录出了mRNA,基因工程操作流程图,小结：,A,2、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是 A用于检测疾病的医疗器械 B用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子 C合成-珠蛋白的DNA D合成苯丙羟化酶的DNA片段,B,4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,寻根问底：,（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。

14、 （2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。 （4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。,1）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,随堂练习,2）有关基因工程的叙述正确的是 A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形

15、成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,随堂练习,4.下表关于基因工程中有关基因操作 的名词及对应的内容，正确的组合是,2、下列属于获取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.,5.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测 C增加质粒分子的分子量 D便于与外源基因连接,6.哪项不是基因表达载体的组成部分( ) A.启动子 B.终止密码 C

16、.标记基因 D.目的基因 7.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法( ) A基因枪法 B显微注射法 C.农杆菌转化法 D花粉管通道法,不可以。 （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,思考与探究：,根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶