第10章现代生物技术的应用

第十章 现代生物技术的应用现代生物技术不仅直接提供 IFN、 IL、 EPO、 CSF等基因工程药物，也广泛用于改造抗生素和生物制品等传统医药工业。 主要体现在以下几个方面 抗生素： 可从产生菌中分离出生物合成酶基因，进行克隆，提高生产菌 的生物量，或得到新的杂合抗生素 氨基酸： 利用生物技术得到基因克隆的生产菌，或采用融合技术提高氨基酸产量 维生素： 构建基因工程菌，简化维生素的生产工艺（如 Vit C） 疫苗： 利用基因工程技术将抗原克隆到 E.coli或酵母中，用工程菌生产疫苗，产量高、工艺简单、操作安全一、 利用现代生物技术改造传统制药工业2第一节 基因工程在抗生素生产中的应用3抗生素生物合成并非单一基因的直接产物，而是由初级代谢产物经过一系列酶催化产生的次级代谢产物，其形成过程是一个复杂的、多因素调节的过程 传统的提高微生物产生抗生素能力的方法主要是用诱变剂（如紫外线、化学诱变剂等）处理微生物，获得生产能力较高的突变株。 80年代，人们开始将 DNA重组技术应用于次级代谢产物的生物合成上；通过生物合成酶基因的分离、质粒的选择、基因重组与转移、宿主表达等方面4一、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法1.抗生素（链霉素）生物合成基因的结构特点 链霉菌抗生素生物合成基因组的一个典型特性是 G-C碱基组成，（ G+C） %高达 70%以上；且三联体密码子中第 3个碱基 G、 C比例极高 抗生素生物合成基因大多处于一个基因族中 抗生素生物合成基因除定位在染色体上外，有的定位于质粒上52.克隆抗生素生物合成基因的策略和方法 在标准宿主系统中克隆检测单基因产物 阻断变株法 突变克隆法 直接克隆法 克隆抗生素抗性基因法 寡核苷酸探针法 同源基因杂交法6 在标准宿主系统中克隆检测单基因产物鸟枪克隆法： 这是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方 法 (如剪切力、超声波等 )或酶化学方法 (如限制性内切核酸酶 )将生物细胞染色体 DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合，将重组 DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的 DNA分离、回收。这种方法也就是应用基因工程技术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组 DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用 “ 溜散弹射击 ” 原理去 “ 命中 ” 某个基因。由于目的基因在整个基因组中太少太小，在相当程度上还得靠 “ 碰运气 ” ，所以人们称这个方法为 “ 鸟枪法 ” 或 “ 散弹枪 ” 实验法利用鸟枪克隆法，把抗生素产生菌 DNA克隆到最常用的宿主 变青链霉菌中，通过检测宿主菌中个别基因产物，筛选克隆，从而分离到相应的基因 7 阻断变株法通过一系列阻断变株的互补结果来确定被克隆 DNA片段的性质。即首先经诱变获得一系列生物合成阻断变株（不能合成抗生素），用互补共合成法来确定这些变株在生物合成途径中的相互位置。从野生型菌株中分离 DNA，与载体连接后转入阻断变株，以抗生素表型的恢复作指标，克隆生物合成不同阶段的酶基因8 突变克隆法利用整合质粒或噬菌体，将原株 DNA转入到抗生素产生菌中。由于基因有同源性，有可能发生基因重组，一旦某 DNA片段的插入干扰了原株某个生物合成基因的转录，即得到这个生物合成基因的阻断变株，其相应的 DNA片段就是这个阶段的生物合成基因此法由于要利用噬菌体，因而有一定局限性9 直接克隆法将抗生素产生菌的部分酶切的 bp的片段连接到质粒的表达位点上，转化变青链霉菌，培养，筛选具有抗菌活性转化子由于抗生素生物合成基因往往成族存在，使得有时可能需要克隆整套生物合成基因。故此法主要用于基因族相对较小（ 30kb ）的抗生素生物合成基因10 克隆抗生素抗性基因法抗生素生物合成基因和抗性基因往往是连锁的，表达也是协同的（否则菌体本身没有抗性，容易被自身所产生的抗生素杀灭），且抗性基因一般只有 kb，容易检测于克隆先将抗性基因克隆到标准宿主或产生菌的敏感突变株中，再分析与之紧密连锁的，就可能找到生物合成基因；也可利用已经克隆的抗性基因作为探针，从产生菌基因文库中分离与之同源的并带有生物合成基因的片段11 寡核苷酸探针法根据抗生素生物合成酶基因的氨基酸序列，推导出其基因序列，然后人工合成寡核苷酸，并以此寡核苷酸作为探针，从基因文库中克隆出相应的生物合成基因12 同源基因杂交法利用一种已经克隆的抗生素生物合成基因片段为探针，探测相关抗生素同源基因，最后分离及克隆抗生素生物合成基因13二、提高抗生素产量在抗生素生产过程中，获得高产菌株的传统方法是通过诱变育种得到的；而利用基因工程技术提高抗生素产量应从以下方面着手1.将抗生素产生菌基因随机克隆到原株直接筛选高产菌株原理： 在克隆菌中，增加某一与产量有关的基因（限速阶段的正性调节基因）的剂量，使产量提高142.增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数抗生素生物合成途径中的某个阶段可能是整个合成中的限速阶段，识别合成途径中的 “限速瓶颈 ”，并设法导入能提高此阶段酶系的基因拷贝数；只要增加的中间产物不对合成途径中的某步骤产生负反馈抑制，就可以增加抗生素的产量。故 增加生物合成中限速阶段酶基因剂量有可能提高抗生素产量153.通过调节基因的作用调节基因的作用可增加或降低抗生素的产量，它常常是抗生素生物合成和自身抗性基因族的组成部分。正性调节基因可加速抗生素的合成，负性调节基因可降低抗生素的产量。因此， 增加正性调节基因或降低负性调节基因也是增加抗生素产量的方法164.增加抗性基因抗性基因通过其产物灭活胞内或胞外的抗生素，保护自身免遭抗生素的杀灭作用；而且有些抗性基因的产物还直接参与抗生素的合成。 抗性基因 经常与生物合成基因连锁， 是激活生物合成基因进行转录的必需成分 。抗性基因必须先进行转录，建立抗性后，生物合成基因的转录才能进行。抗生素的生产水平是由抗生素生物合成酶与对自身抗性的酶所共同确定17三、改善抗生素组分许多抗生素产生菌可以同时产生多种抗生素，这些组分的化学结构和性质非常相似，而其生物活性有时却相差很大随着对各种抗生素生物合成途径的深入了解及基因重组技术的发展应用基因工程技术可定向改造抗生素产生菌，获得只产生有效成分的菌种18四、改造抗生素生产工艺1.抗生素产生菌一般对氧供应较敏感，供氧不足往往是高产发酵的限制因素。在培养过程中，进入液相培养基的氧分子需穿过几层界膜，进入菌体后，再经物理扩散，才能到达相应的呼吸细胞器。 若在菌体内导入血红蛋白基因，提高呼吸细胞器对溶氧的亲合力，从而提高细胞对溶氧的利用率2.在抗生素产生菌中引入耐高温的调节基因 ，或耐热的生物合成基因，可使发酵温度提高，降低生产成本19五、产生杂合抗生素杂合抗生素： 应用遗传重组技术改造菌种，产生新的工程菌，制备的新型抗菌活性化合物1.不同抗生素生物合成基因重组2.生物合成途径中某个酶基因的突变3.在生物合成途径中引入一个酶基因4.利用底物特异性不强的酶催化形成新产物20第二节 基因工程在氨基酸和维生素生产中的应用21一、在氨基酸生产中的应用1.在酶法生产方面，主要通过克隆某些酶系基因来生产氨基酸如 在 L-Trp生产中，利用色氨酸合成酶基因和丝氨酸转羟甲基酶基因的重组质粒，在 E.coli中克隆化 ;可使 L-Trp产量高达 9g/L2.在利用转氨酶反应生产氨基酸方面，将相应的转氨酶基因克隆到工程菌中22二、在维生素生产中的应用简化维生素的发酵工艺如 Vit.C的传统生产工艺为 “ 两步发酵法 ” 。如今可将第二步发酵菌株中与发酵生产 Vit.C相关的基因转移至第一步菌株中，构建成新的工程菌株，这样 Vit.C的生产过程只需一步发酵即可完成23第三节 基因工程在生物制品制造中的应用24传统方法制备疫苗：免疫动物 动物培养 抽血 分离纯化 冻干保存有的疾病由于病原微生物具有高度的寄主专一性（如乙肝病毒），只能感染人及与人亲缘关系近的动物（如黑猩猩），故不能用传统方法制备基因工程疫苗制备：寻找病原微生物的致病基因，通过高表达质粒转入相应的宿主，制备成基因工程菌，然后培养工程菌，表达出相应疫苗2526二、现代生物技术在食品工业方面的应用生物技术是对生命有机体进行加工改造和利用的技术， 它是 2 1世纪高新技术的核心之一。目前，生物技术已被应用于工农业、食品加工、医疗保健等众多领域中。而食品生物技术是生物技术的重要分支学科，主要指生物技术在食品工业中的应用，其作用主要体现在 四个方面 ， 一是 利用基因工程、细胞工程技术对食品资源的改造和改良 ； 二是 利用发酵工程、酶工程技术将农副原材料加工制成商品，如调味品、酒类、酸奶等发酵制品； 三是 利用这些生物技术产品进行二次开发，形成新的产品，如高果糖浆，食用添加剂等； 四是 利用酶工艺、发酵技术、生物反应器等对传统食品加工工艺进行改造，降低能耗、提高产率、改善食品品质等。 另外，在食品生产相关领域如食品包装、食品检测等方面，食品生物技术也得到越来越广泛的应用。所以生物技术在食品领域的应用有着广阔的市场和发展前景。生物技术简介：2728生物技术：生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程 5个方面。该技术是应用生物体（微生物、动物细胞、植物细胞）或其组成部分（细胞器、酶）在最适宜条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。 基因工程微生物蛋白质或酶动植物个体或细胞工程菌 发酵工程蛋白质或酶工程 特定产品细胞工程优良品系29基因工程：基因工程是以分子遗传学为基础，以 DNA重组技术（克隆技术）为手段，用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、组合、拼装，形成基因重组体，然后把