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免疫学原理及检测,技术支持部 胡贺,主要内容,免疫学基本内容 血清学一般特点 ELISA方法的技术根据 ELISA方法的种类 影响因素 中山生物产品 各类产品简介,免 疫 学,一门自然科学，从研究机体对传染病的抵抗力开始，是微生物学的一个分支，但随着科技的发展，成为了一门独立的学科。,免疫学反应,是抗原与抗体的反应，仅在高等脊椎动物中存在。 这是已知的最精妙复杂的身体抵御外部物质的系统。,抗原(Antigen),抗原是指能刺激机体免疫系统产生免疫应答而生成抗体和致敏淋巴细胞等免疫应答产物，并能与之发生特异性结合的物质。 具有免疫原性和反应原性。一般抗原都是外来物，如细菌、病毒、寄生虫、大分子蛋白等 。,抗体(Antibody),机体受外来抗原物质刺激后，产生的一种能与该抗原发生特异性结合的免疫球蛋白(Ig)。,免疫球蛋白分类,Ig通常是指具有抗体活性和（或）抗体样结构的球蛋白。应用免疫电泳与超速离心分析可将Ig分5类： IgG、IgA、IgM、 IgD、 IgE。 IgG：含量最多或最主要的Ig（75%），唯一能够通过胎盘的Ig。主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞合成与分泌。 IgM：分子量最大，由5个IgM单体通过J链连接。是最早出现的Ig，是抗原刺激后最早出现的抗体，其杀菌、溶菌、溶血、促吞噬以及凝集作用比IgG高5001000倍,IgG抗体的结构及与抗原的反应,血清学反应的一般特点,1、抗原、抗体的结合具有特异性，但当有共同抗原、抗体存在时，会出现交叉反应。 2、抗原、抗体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定，但是可逆的。 3、抗原、抗体的结合是按一定比例进行的，只有比例适当时，才能出现可见反应。,最适比例示意图,4、血清学反应大体分为两个阶段进行，但其间无严格界限。第一阶段为抗原抗体特异性结合阶段，反应速度很快，只需几秒至几分钟反应即可完毕，但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗原抗体反应的可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。反应速度慢，需几分、几十分以至更长时间。,血清学反应的一般特点,酶联免疫吸附试验 enzyme linked immuno- sorbent assay ELISA,ELISA方法的技术根据,抗原或抗体能结合到固相载体的表面，并保持其免疫活性。 抗原或抗体与酶连接所形成的结合物仍保持免疫学和酶的活性。 在测定时待测血清与固相载体的抗原或抗体结合，然后再加入酶标记的抗原或抗体，形成复合的结合物，最后加入底物溶液，与酶反应的颜色深浅与标本中相应抗原或抗体的量成比例。,ELISA 方法的种类,双抗体夹心 ELISA 法示意图,影响因素,试剂因素 标本因素（内源性、外源性） 操作因素,试剂因素,选择优良的检测试剂，操作前平衡到室温 不同批号的试剂不能混用 在有效期内使用,标本因素(外源性干扰),标本应避免溶血，细菌的污染(假阳性)； 抗凝不完全的标本(假阳性)，建议尽量不用抗凝剂血尤其是肝素抗凝剂； 标本保留时间过长(间接法本底值增高)，如需保存一周以上，则应-20保存,融解后应充分混匀； 标本间应避免交叉污染，不应与生化标本共用同一管标本； 不能用NaN3防腐。,标本因素(内源必干扰),类风湿因子（假阳性） 检测抗原时可用2-巯基乙醇加入到标本稀释液中,使其降解或F(ab)2代替完整IgG。 补体（假阳性） 可用EDTA稀释标本或灭活补体。 嗜异性抗体、自身免疫性抗体、交叉反应物质等。,操作时影响因素,加样应加在孔的下1/3处，注意不可溅出或有气泡产生。 加样应每人一吸头，防止交叉污染。 样本的稀释(目的是减少非特异性反应) 要先加稀释液再加标本并用微量振荡器混匀30秒。 加试剂时应摇匀并弃去第一滴。 洗涤应彻底。,中山生物产品,乙肝两对半（缺少e抗原） 丙肝 梅毒 EB病毒 登革热 G6PD,乙型肝炎病毒血清标志物检测, 常用ELISA法检测。 目前HBsAg诊断试剂质量较高，灵敏度可达 0.2ng/L。从全国室间质控评价结果显示，阳 性标本率达到或超过98。 HBsAg滴度越高，HBeAg、HBV DNA阳性的可能性越大。 血液与肝组织的HBsAg含量并不完全相关。,HBsAg,为什么血清HBsAg阴性不能排除HBV感染？ 检测试剂不够敏感。 S基因变异（抗原性发生改变）。 X基因变异（转录受抑制）。 重叠HCV感染（干扰HBsAg合成）。,如何诊断血清HBsAg阴性的HBV感染？ 提高检测敏感性 采用针对变异抗原的检测试剂 HBV DNA的检测 组织中标志物的检测,阳性就万无一失了吗？ 低滴度应注意假阳性 单一HBsAb阳性HBV DNA检出率0-11.8%： 先后感染了不同的HBV亚型 S基因变异 X基因变异,HBsAb,HBsAb阳性HBV DNA阴性 并不排除肝细胞内HBV的存在, 可出现在HBV感染的恢复期，此时HBsAg未 消失，HBsAb已产生，大部分归功于检测敏 感性的提高。 S基因发生变异，野生株HBsAb不能将其清 除； HBsAb阳性者感染了不同亚型HBV或免疫逃 避株。,HBsAg 与 HBsAb共存, 是重要的免疫耐受因子，大部分情况下其存 在表示患者处于高感染低应答期。 HBeAg与HBV DNA有良好的相关性。 阳性标本检出率90左右。,HBeAg,HBeAg与HBeAb,HBeAg的存在表示病毒复制活跃且有较强的传染性。 HBeAg消失而HBeAb产生称为血清转换。 HBeAb阳转后，病毒复制多处于静止状态，传染性降低。长期HBeAb阳性者并不代表病毒复制停止或无传染性，研究显示20%50%仍可检测到HBV DNA，部分可能由于前C区基因变异，导致不能形成HBeAg。,HBeAg与HBeAb共存 血清转换过程中。 检测敏感性提高。 野生株与变异株同时存在。,HBcAb, 反映肝细胞受到HBV侵害的一种指标，主要包括 IgM、IgG、IgA。 抗HBc IgM阳性是最早出现的特异性抗体，是诊 断急性乙型肝炎和判断病毒复制活跃的指标，并 提示病人的血液有强传染性。也见于慢性活动性 肝炎。 抗HBc IgG 其阳性滴度高，表明患有乙型肝炎， 指正在感染；低滴度为既往感染指标，体内时间 长。,乙型肝炎病毒各项标志物 检测的临床意义,临床二对半检测常见模式,？,建议每个病人都要进行 HBV DNA检测,HBV DNA检测的临床意义,1、诊断方面： HBV DNA是HBV存在最直接的依据 HBV DNA是HBV复制的标志 HBV DNA是患者具有传染性的标志,（4） 对HBV-M起补充作用： HBeAg()/ HBeAb()乙型肝炎 （前C区变异） HBsAg()乙型肝炎 （S区变异） 低水平感染 单项抗HBc()乙型肝炎,HBV DNA检测的临床意义,2、 疗效判断： HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效 最敏感的指标 。 3、预后判断： HBV DNA水平与病情有一定的关系。,HBV DNA检测的临床意义,调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳”的病人HBV都无复制。因此，要准确知道HBV是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBV DNA来决定。,为什么建议每个病人都要进行 HBV DNA检测？,！,HBsAg和HBeAg均阳性而HBV DNA阴性 可能的原因： 干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。 PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结合。 病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBV DNA很少或缺乏。,丙型肝炎,HCV抗体不是保护性抗体，是存在HCV感染的标志。抗HCV IgM在发病后即可检测到，一般持续13个月。如果抗HCV IgM持续阳性，提示病毒持续复制，易转为慢性。低滴度抗HCV IgG提示病毒处于静止状态，高滴度提示病毒复制活跃。,HCV RNA HCV RNA阳性是病毒感染和复制的直接标志。HCV RNA亦可定量，定量测定有助于了解病毒复制程度、抗病毒治疗的选择及疗效评估等。,为什么要同时检测 抗HCV 及 HCV RNA？, 抗病毒治疗的要求。 防止漏诊。 有报道223例丙型肝炎病例中，抗HCV和 HCV RNA同时阳性86例，单纯抗HCV阳性 118例，单纯HCV RNA 阳性19例。 表明单做其中一项可能导致漏诊。,艾滋病血清学检测, 初筛试验：酶联免疫吸附试验（ELISA） 用于对检测对象感染情况的初步筛查，检测结 果可能会有假阳性，不能发抗体阳性报告。 确认试验：免疫印迹法（Western Blot） 确定检测对象是否有HIV抗体，可发抗体阳性 报告。,第一代 ELISA 试剂,标记抗原：全病毒裂解抗原 优点：灵敏度高，可检出各种抗体 缺点：制备麻烦，成本高，假阳性 1985年，FDA批准第一个HIV抗体筛选试剂,第二代 ELISA 试剂,标记抗原：重组或合成多肽抗原 优点：重组抗原可消除HLA所致的抗体假阳性，生产成本低.不使用HIV病毒颗粒，较为安全，敏感性特异性较高 缺点：仍有一定的假阳性 1990年，FDA批准第一个重组抗原筛选试剂。,第三代 ELISA 试剂,标记抗原：重组或合成多肽 优点：可检测所有不同种类的抗体，增加了试剂的敏感性和特异性 1994年发展了双抗原夹心法，酶标物由抗人 IgG改变为特异性HIV抗原。,第四代 ELISA 试剂,标记物：重组或多肽抗原+重组抗体 优点：同时检测HIV抗原抗体，缩短窗口期 注意：抗原检测敏感性低于单独抗原试剂(20100pg/ml, 3.510pg/ml) 1998年第四代试剂首次上市。,快速检测试验,特点： 1、操作简便、快速； 2、普通室温下可以完成，无需特殊仪器； 3、判读受主观因素影响。 适用范围： 野外、紧急情况 。,HIV “窗口期”,ELISA法检测假阳性的原因,由于仪器或加样头造成的交叉污染 潮湿或试剂滴漏 底物被金属离子污染 洗板不充分 读取错误 生物因素,抗体初筛试验的局限性,阳性结果不能确认，需用其他试剂复查。 阴性结果不能排除HIV感染： 在感染早期，血清阳转前存在“窗口期”，在感染晚期，某些抗体可能检测不到（如p24抗体）。 反应中抗体过量，抗原抗体比例不合适而不能形成特定结构，出现凝集抑制。 不能诊断18月龄婴儿的母婴垂直感染。 新出现的亚群难以检测。,梅 毒（syphilis）,由梅毒螺旋体引起的慢性全身性疾病 梅毒螺旋体每3033小时繁殖一次，为厌氧微生物，在体外很容易死亡 梅毒分为三期：一期和二期梅毒病程在2年以内称为早期梅毒，三期梅毒病程已超过2年称为晚期梅毒 传播途径：主要为性行为传播，少数通过间接感染或血液,起源及流行情况,15世纪末,梅毒起源并广泛流行于欧洲, 通过商业往来，也进入了我国，于1505年在广东省首先发现梅毒病例，此后，梅毒便从沿海到内地在我国广泛传播开来，发病率居高不下，居性病之首。 解放后，党和政府有效地取缔了妓院，对性病进行广泛的普查普治，经过十年的努力，已于 1959年基本上消灭了梅毒。 1964年我国向全世界宣布基本消灭了性病，这一举动震惊了世界，轰动了全国。,世界各国积极防治,在美国、澳大利亚、加拿大以及欧洲发达国家等，已经将梅毒的预防和治疗纳入到公共卫生的范畴 在全球层次上，已经提出了消灭胎传梅毒的全球行动策略 在我国，目前已经开始制定全国梅毒控制规划,梅毒检测方法,病原体检查：硬下疳部位的分泌物见到螺旋体 梅毒血清学检查 常规筛查方法：非梅毒螺旋体抗原血清试验（性病研究实验室试验、不加热血清反应素玻片试验） 若筛查阳性，应做梅毒螺旋体抗原血清试验（荧光密螺旋体抗体吸收试验、梅毒螺旋体血凝试验），测定血清特异性抗体,现在通常是用梅毒血清学的检测来加以诊断，目前各大医院比较常用的是RPR（快速血浆反应素环状卡片试验）和TPHA（梅毒螺旋体血球凝集试验）。 ELISA检测梅毒螺旋体抗体试剂盒则主要应用于大规模梅毒筛查,如血筛,流行病筛查等。,EBV&鼻咽癌(NPC),鼻咽癌简介,鼻咽癌又称广东癌，高发于我国广东广西及东南亚，我国35岁儿童90%以上已感染EB病毒，华南地区人群的感染率接近100%。早期无明显症状，不易发现。是我国死亡率最高的10大恶性肿瘤之一。 主要受遗传因素、EB(Epstein-Barr)病毒感染以及某些环境因素相互影响而形成,微生物学检查,EBV分离培养较困难，一般用血清学方法做辅助诊断： 1、EBV特异性抗体检测，对鼻咽癌早期诊断有 很大帮助； 2、异嗜性抗体检测：主要用于诊断传染性单 核细胞增多症。 EBV核酸检测：原位核酸杂交或PCR,G6PD,6-磷酸葡萄糖脱氢酶（蚕豆病） 是一种遗传性酶缺乏病。我国高发区，南高北低，主要分布在长江以南各省，以海南广东 广西 云南 贵州 四川等省为高。 病因是由于G6PD基因突变，导致该酶活性降低红细胞不能抵抗氧化损伤而遭受迫坏，引起溶血性贫血。,临床表现,G6PD缺乏症的临床表现与一般溶血性贫血大致相同。分新生儿黄疸、蚕豆病、药物性溶血、感染性溶血、非球形细胞溶血性贫血等临床类型。 因G6PD缺乏诱发的严重的急性溶血性贫血因红细胞破坏过多，如不及时处理，可引起肝、肾、或心功能衰竭，甚至死亡。 G6PD缺乏症又是新生儿病理性黄疸的主要原因。据中山医大的一项统计表明，患G6PD缺乏症的新生儿中，约50%的患儿会出现新生儿黄疸，其中约12%可发展为核黄疸，导致脑部损害，引起智力低下。,遗传方式,G6PD缺乏症属X连锁不完