2013培训讲稿-目基因克隆及表达

一、质粒概

目的的克隆及表把一个有用的目的DN段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)DNA技术中常用的载体。质粒(Plasmid)是一种外的稳定遗传因子，大小从1～200kb不等，为双链、闭环DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应操作而进行人工构建的。一个理想的克隆（1）（2）（3）（4）DNADNADNA(OpencircularDNAocDNA)；线状DNA(LinearDNA)。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速外源DN段和质粒载体的连接反应策略有以下几种1补的粘性末端这也是最容易克隆的N段一般情况下常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点因而几乎总能找到与外源N段末端匹配的限R片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体DNA3DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG8000)以促进DNA分子凝聚成体的物质以提高转化效率。\外源DN段和质粒载体的主要类型有 所用克隆载体有pMD18-TSimple和pMD18-T。T载体是TA克隆载体的简称，就是利用载体的T末端和PCR产物的A末段连接而将目的PCR产物的纯化回收讲解PCRSolutionpMD18-TSimple4.55μL102目的片段与表达载体的连接本所有的表达载体有原核表达载体和真核表达pPG612为例。这类载体主要采用带有非互补突出端的片段的连接反应策略。pMD18-TSimple-NpMD18-TSimple- 50 5 510× 10 30总体 100373-6h2μL0.8％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果，酶切充分后切胶纯化回收，40-50μL去离子水洗脱，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测回收产物并测浓度。apET-28apET-28a/TG1，pPG612/TG1菌种，37pET-或pPG612（试剂盒。0.8％琼脂糖凝胶电泳检测回收产物并测浓度。b、表达载体的双酶切： 30 5 510× 10 50总体 100373-6h2μL酶切样0.840-50μL去离子水洗脱，0.8mol对应g，umolug。apET-28a1.5mLEP10×T4DNALigase 目的片 表达载 T4DNALigase(宝生物 总体 bpPG6121.5mLEP10×T4DNALigase 目的片 表达载 T4DNA 总体 传、工程等研究领域的基本实验技术。转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺（一）1、从-705min2100-200uL（克隆或表达感受态30min45min。5500uL～800uLLB液体培养基（无菌条件下7100uL～200uLAmp+Kan+Cm+LB2、质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化DNADNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。一般情况下，DNA5％。4-6个阳性克隆子摇菌培养提取质粒，分别进行单酶切、双酶切以及从1、PCRU1引 L1引 TaqDNA聚合 去离子 总体 10μL后再添加模板（半个菌落大肠杆菌质粒手提操作1.5MLEP管中，120001（菌体200μLSolutionI（4℃存放，使用移液器彻底悬浮细5分钟。5分钟。将上清地转移到新的EP管中，添加异丙醇至1.5ML，室温静置2分钟，120005分钟。尽弃上清，EP管倒置在吸干液体。添加1ML的70%乙醇（4℃存放，上下翻转3-5次后12000转离心1分钟，EP管倒置在吸干液体。7).EP550μL的去离子水溶解质粒。1.5mL过夜培养菌液，12000r/min5min250μLBufferP1（含RNaseA）充分振荡菌体沉淀至彻底悬浮；250μLBufferP26-10350μLBufferP36-10次以混匀，12000r/min将上清移入吸附柱中，12000r/min1min700μLPW液，12000r/min1min500μLPW液，12000r/min1min1.5在吸附膜加入60μL去离子水（65度预热室温静置2min，12000r/min离心1min，DNA，-20℃保存备用。注：BufferP1Buffer用后拧紧盖子。乳酸菌菌质粒提12000r/min5min500μL溶菌酶，充分振荡菌体沉淀至彻底悬浮，3760min15min振荡一次，12000r/min2min，尽弃上清。1mL离子水悬浮菌体，12000r/min5minEP250μLBufferS15min；350μLBufferS36-8次以混匀，12000r/min将上清移入吸附柱中，12000r/min1min500μLW1液，12000r/min1min700μLW2液，12000r/min1min2min3