克隆基因的表达与产物纯化外源基因在真核细胞中的表达

克隆基因的表达与产物纯化外源基因在真核细胞中的表达第一页，共九十二页，编辑于2023年，星期五酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。真核或病毒启动子MCSPolyA信号终止子外源基因第二页，共九十二页，编辑于2023年，星期五CONTENTS一、酵母基因工程二、昆虫培养细胞表达系统四、在哺乳动物细胞中表达三、外源基因在植物中表达第三页，共九十二页，编辑于2023年，星期五一、酵母基因工程酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征酵母菌的宿主系统酵母菌的载体系统酵母菌的转化系统酵母菌的表达系统利用重组酵母生产乙肝疫苗第四页，共九十二页，编辑于2023年，星期五酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。A酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征酵母菌的分类学特征第五页，共九十二页，编辑于2023年，星期五酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉能将外源基因表达产物分泌至培养基中不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（GenerallyRecognizedAsSafeGRAS）酵母菌是最简单的真核模式生物第六页，共九十二页，编辑于2023年，星期五B酵母菌的宿主系统广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌第七页，共九十二页，编辑于2023年，星期五广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）

毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）

其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。第八页，共九十二页，编辑于2023年，星期五提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型突变类型生物效应作用位点Ssc1改善重组蛋白分泌钙离子依赖型的ATP酶ssc2

提高重组蛋白表达转录后加工rgr1提高重组蛋白表达转录水平ose1

提高重组蛋白表达转录水平Ssc11改善重组蛋白分泌羧肽酶Yrho-

提高重组蛋白表达转录水平第九页，共九十二页，编辑于2023年，星期五抑制超糖基化作用的突变宿主菌

许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。突变类型生物效应mnn

甘露糖生物合成缺陷型alg

天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型Och

外侧糖链添加缺陷型能抑制超糖基化的突变类型第十页，共九十二页，编辑于2023年，星期五C酵母菌的载体系统酵母菌中的野生型质粒酵母菌克隆表达质粒的构建第十一页，共九十二页，编辑于2023年，星期五酵母菌中的野生型质粒酿酒酵母中的2µ环状质粒几乎所有的酿酒酵母中都含有2µ双链环状质粒，拷贝数达50至100个。含有自主复制起始区（ori）和STB区，STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。

2μplasmid：从酵母菌天然的质粒上截取一段包含复制序列的2μDNA。

其特点是非常稳定，可确保細胞分裂时，质粒的性状可移交到子代中不会遺失。

而且是high-copynumber的质粒。第十二页，共九十二页，编辑于2023年，星期五酵母菌中的野生型质粒乳酸克鲁维酵母中的线状质粒乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线状质粒pGKL1和pGKL1

拷贝数为50-100个，分别携带K1K2两种能使多种酵母菌致死的毒素蛋白编码基因（αβγ），同时含有毒素蛋白抗性基因。第十三页，共九十二页，编辑于2023年，星期五酵母菌克隆表达质粒的构建含有ARS的YRp质粒的构建ARSplasmid：从酵母菌的染色体中截取一段ARSelement，

ARS是表示Autonomouslyreplicatingsequence。

ARS-containingplasmid的稳定性较差，质粒常被分解而无法代代相传。

但是若加入一段centromere(CEN)sequence(称CENplasmid)，就可使质粒稳定性提高。

但是其copynumber较低，一般只有singlecopy。

第十四页，共九十二页，编辑于2023年，星期五酵母菌克隆表达质粒的构建含有ARS的YRp质粒的构建ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。以ARS为复制子的质粒称为YRp

以2µ质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。第十五页，共九十二页，编辑于2023年，星期五酵母菌克隆表达质粒的构建含有CEN的YCp质粒的构建CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列将CEN

DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp

（酵母着丝粒质粒）YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个第十六页，共九十二页，编辑于2023年，星期五酵母菌克隆表达质粒的构建含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域。第十七页，共九十二页，编辑于2023年，星期五D酵母菌的转化系统酵母菌的转化程序转化质粒在酵母细胞中的命运用于转化子筛选的标记基因第十八页，共九十二页，编辑于2023年，星期五酵母菌的转化程序酵母菌原生质体转化法早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%。但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%第十九页，共九十二页，编辑于2023年，星期五酵母菌的转化程序碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性：吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍共转化现象极为罕见第二十页，共九十二页，编辑于2023年，星期五酵母菌的转化程序酵母菌电击转化法酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率可高达105

/µgDNA。第二十一页，共九十二页，编辑于2023年，星期五转化质粒在酵母细胞中的命运单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体这对于体内定点突变酵母基因组极为有利克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的50-80%第二十二页，共九十二页，编辑于2023年，星期五用于转化子筛选的标记基因营养缺陷型的互补基因用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因和显性基因两大类营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA尿嘧啶等

但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难第二十三页，共九十二页，编辑于2023年，星期五用于转化子筛选的标记基因显性标记基因显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白标记基因编码产物遗传表型aph氨基糖苷转移酶抗G418cat氯霉素乙酰转移酶抗氯霉素Dhfr二氢叶酸还原酶抗氨甲喋呤和磺胺Cup1铜离子螯合物耐受铜离子suc2蔗糖转化酶耐受高浓度蔗糖ilv2乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草剂第二十四页，共九十二页，编辑于2023年，星期五E酵母菌的表达系统酵母菌启动子的可控性外源基因在酵母菌中表达的限制因素酵母菌表达系统的选择第二十五页，共九十二页，编辑于2023年，星期五酵母菌启动子的可控性温度控制型启动子pho4TS-PHO5启动子：

酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35℃时失活因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35℃时关闭23℃诱导表达第二十六页，共九十二页，编辑于2023年，星期五酵母菌启动子的可控性超诱导型启动子酿酒酵母的半乳糖利用酶系由GAL1GAL7和GAL10基因编码半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达第二十七页，共九十二页，编辑于2023年，星期五外源基因在酵母菌中表达的限制因素外源基因稳态mRNA的浓度外源基因mRNA的翻译活性酵母菌对密码子的偏爱性

在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%

以上的氨基酸是由25个密码子编码的第二十八页，共九十二页，编辑于2023年，星期五

酵母菌表达系统的选择酿酒酵母表达系统酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH

、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。第二十九页，共九十二页，编辑于2023年，星期五

酵母菌表达系统的选择乳酸克鲁维酵母表达系统乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也能稳定遗传40代以上。乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。第三十页，共九十二页，编辑于2023年，星期五

酵母菌表达系统的选择巴斯德毕赤酵母表达系统巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。第三十一页，共九十二页，编辑于2023年，星期五

酵母菌表达系统的选择多型汉逊酵母表达系统多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARS质粒能高频自发地整合在受体的染色体DNA上，甚至可以连续整合100多个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获得成功表达。第三十二页，共九十二页，编辑于2023年，星期五F利用重组酵母生产乙肝疫苗由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重的传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为HBV携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠的保证。第三十三页，共九十二页，编辑于2023年，星期五乙型肝炎病毒的结构与性质产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母第三十四页，共九十二页，编辑于2023年，星期五乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具有感染力的病毒。颗粒呈球面状，直径为42nm，基因组仅为3.2kb。病毒颗粒的主要结构蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化结构和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（HBcAg）、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的22nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。第三十五页，共九十二页，编辑于2023年，星期五乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因第三十六页，共九十二页，编辑于2023年，星期五乙型肝炎病毒的结构与性质传统乙肝疫苗的制备乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。第三十七页，共九十二页，编辑于2023年，星期五产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，主要工作包括将S多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均颗粒直径为22nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%。进一步的研究表明，M多肽和L多肽对S型疫苗具有显著的增效作用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对S抗原缺乏响应的人群的免疫反应。第三十八页，共九十二页，编辑于2023年，星期五

产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建第三十九页，共九十二页，编辑于2023年，星期五

产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母重组巴斯德毕赤酵母的性能由于巴斯德毕赤酵母染色体DNA上还拥有第二个乙醇氧化酶基因AOX2，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲醇诱导HBsAg表达，最终S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3%

。在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发酵罐中培养，最终可获得90克22nm的HBsAg颗粒，足够制成900万份乙肝疫苗。第四十页，共九十二页，编辑于2023年，星期五二、昆虫培养细胞表达系统1.杆状病毒（Baculovirus）广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。（1）侵染周期：第四十一页，共九十二页，编辑于2023年，星期五第四十二页，共九十二页，编辑于2023年，星期五（2）杆状病毒的表达特点①感染后36-48h，病毒开始合成大量的多角蛋白。②多角蛋白的启动子特别强。③多角蛋白基因可以被替换掉而不影响病毒的繁殖。第四十三页，共九十二页，编辑于2023年，星期五（3）杆状病毒载体转化过程①转移载体中插入外源基因②转移载体与野生型AcMNPVDNA共同转染宿主细胞③转移载体与病毒基因组发生双交换④外源基因被交换转入病毒基因组中⑤重组病毒侵染宿主4-5天后即可收获重组蛋白。第四十四页，共九十二页，编辑于2023年，星期五第四十五页，共九十二页，编辑于2023年，星期五第四十六页，共九十二页，编辑于2023年，星期五2.最普遍应用的宿主细胞株3.转化子筛选源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，多角蛋白的启动子特别活跃。多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体。通过显微镜检查看是否有多面体形成。第四十七页，共九十二页，编辑于2023年，星期五4.目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中表达的外源蛋白第四十八页，共九十二页，编辑于2023年，星期五杆状病毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内表达外源蛋白，成为“低成本蛋白工厂”。22只粉蚊夜蛾幼虫4天后表达的人腺苷酸脱氢酶占幼虫总蛋白的2%-5%。共产出9mg很纯的产物。5.杆状病毒大规模表达存在的问题（1）寿命短（2）共同转染率低感染4-5天后宿主细胞裂解或幼虫死亡。重组率更低。0.1%-1%。第四十九页，共九十二页，编辑于2023年，星期五6.构建可持续表达的载体利用AcMNPV的一个早期基因IE1的启动子。IE1基因的转录不依赖于病毒的其他基因产物，而且在昆虫细胞中表达正常。把外源基因插入到IE1启动子和IE1终止子之间，构成整合型载体。载体转染宿主细胞后随即整合到宿主染色体上，实现外源蛋白的持续表达。载体IE1启动子外源基因

IE1终止子载体第五十页，共九十二页，编辑于2023年，星期五三、外源基因在植物中表达1.Ti质粒存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumorinducingplasmid）。第五十一页，共九十二页，编辑于2023年，星期五第五十二页，共九十二页，编辑于2023年，星期五（1）Ti质粒的结构环状双链DNA，1.5×105-2.0×105bp（185kb）(相当于细菌染色体的3%-5%）。第五十三页，共九十二页，编辑于2023年，星期五①T-DNA（transfer-DNA）转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。生长素细胞分裂素

冠瘿碱基因基因

合成右边界左边界生长素基因:iaaM（tms1）和iaaH（tms2）编码合成吲哚乙酸（植物生长激素）的酶iaaM:色氨酸-2-单加氧酶，iaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶第五十四页，共九十二页，编辑于2023年，星期五第五十五页，共九十二页，编辑于2023年，星期五②毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移，进入和整合。vir的产物能诱导Ti质粒产生T-DNA区域的单链拷贝。单链拷贝从Ti质粒脱离后，可与vir的产物VIRD2蛋白结合，并在VIRD4和VIRB蛋白的帮助下穿过浓杆菌内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上。单链的5’端是右边界区域，含有25bp重复序列，参与整合。第五十六页，共九十二页，编辑于2023年，星期五③冠瘿碱代谢基因④不相容性基因章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因：分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶。维持农杆菌生长。控制Ti质粒的不相容性。第五十七页，共九十二页，编辑于2023年，星期五2.农杆菌的感染和生存（1）第一步:植物受伤植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、α羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的毒性基因表达。第五十八页，共九十二页，编辑于2023年，星期五（2）第二步：感染植物（3）第三步：毒性基因（vir）表达（4）第四步：T-DNA转移（5）第五步：诱导冠瘿瘤农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。virA、virG、virD、virBT-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。第五十九页，共九十二页，编辑于2023年，星期五第六十页，共九十二页，编辑于2023年，星期五（6）第六步：土壤农杆菌代谢冠瘿碱第六十一页，共九十二页，编辑于2023年，星期五3.Ti质粒的种类根据所编码的冠瘿碱（opine），分为（1）章鱼碱（octopine)型质粒第六十二页，共九十二页，编辑于2023年，星期五（2）胭脂碱（nopaline）型质粒（3）农杆碱（agropine）型质粒第六十三页，共九十二页，编辑于2023年，星期五4.Ti质粒转化的对象5.Ti质粒作为载体的可能性（1）能够自发地整合到植物的染色体上。（2）能转化多种植物。（3）强启动子：T-DNA的opine合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米）。第六十四页，共九十二页，编辑于2023年，星期五6.天然Ti质粒作载体的缺点（1）分子量太大（200kb）！（2）限制性酶切位点太多。（3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能再分化。（4）在大肠杆菌中不能复制。第六十五页，共九十二页，编辑于2023年，星期五7.Ti质粒的改造（1）保留T-DNA的转移功能部分（vir基因，左右边界）。（4）冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。（2）减少限制性酶切位点，引入单一插入位点。（3）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植物细胞不再成为肿瘤，能正常分化。（5）加入大肠杆菌的ori和选择标记。（6）加上真核生物的转录信号和结束信号以及添加polyA的信号序列。第六十六页，共九十二页，编辑于2023年，星期五第六十七页，共九十二页，编辑于2023年，星期五8.Ti载体的类型（1）共整合载体（cointegratevectors）最早获得广泛应用的Ti质粒是比利时科学家P.Zambrisky等1983年改造的pGV3850需要同源重组才能插入外源基因。①pGV3850的特点：是一种受体质粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322质粒作为中间载体。第六十八页，共九十二页，编辑于2023年，星期五第六十九页，共九十二页，编辑于2023年，星期五②选择标记1）脓杆菌选择标记宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。2）最终受体植物的选择标记卡那霉素抗性（Kanr）基因（卡那霉素对植物有剧毒！）位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因（nos）。第七十页，共九十二页，编辑于2023年，星期五③外源基因插入pGV3850的过程第七十一页，共九十二页，编辑于2023年，星期五pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同pGV3850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得到抗卡那霉素性状。第七十二页，共九十二页，编辑于2023年，星期五第七十三页，共九十二页，编辑于2023年，星期五（2）双元载体（binaryvectors）既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。①双元载体的结构Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。大幅度减小质粒的体积。（<10kb）Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）第七十四页，共九十二页，编辑于2023年，星期五第七十五页，共九十二页，编辑于2023年，星期五②双元载体的转化1）基因插入转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。Vir产物使双元载体上的T-DNA左右边界及其外源基因转入到植物细胞，并整合到植物染色体上。2）帮助质粒（helperplasmid）受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提供vir产物。第七十六页，共九十二页，编辑于2023年，星期五第七十七页，共九十二页，编辑于2023年，星期五四、在哺乳动物细胞中表达1.动物细胞基因克隆和表达载体—SV40病毒2.人乳多空BK病毒载体第七十八页，共九十二页，编辑于2023年，星期五1.动物细胞基因克隆和表达载体—SV40病毒常用的SV40载体，是从猿猴空泡病毒SV40（simianvacuolatingvirus40）改造而来的。第七十九页，共九十二页，编辑于2023年，星期五（1）SV40病毒的结构①