紫花苜蓿组织培养再生植株的研究

紫花苜蓿组织培养再生植株的研究

关于苜蓿组织培养的培养基和培养方法自30年来，植物组织和细胞种植的科学研究取得了迅速发展，尤其是在植物育种中的一些独特优势。如利用胚胎培养技术克服杂交不孕;用子房或胚珠培养进行人工授粉或试管受精获得杂种后代;用花药培养进行单倍体育种以缩短育种周期和提高选择率,获得纯合二倍体;通过胚乳培养选育三倍体;利用原生质体培养进行体细胞杂交,外源遗传物质的导入以及突变体筛选等。它具有增殖率高,周期短,占用空间小,不受季节限制,可以严格地控制培养条件等优点。紫花苜蓿在我国已有2,000余年的栽培历史,全国栽培面积现已达1,600万亩,是我国最重要的豆科牧草。因此,开展对苜蓿组织培养的研究具有很大的意义。1972年,美国学者Saunders等人从未成熟的花药、子房、子叶愈伤组织分化再生苜蓿植株成功,标志着苜蓿组织培养研究的开始。此后,进行了大量的研究,采用不同的分生组织、器官或原生质体,应用多种培养基和培养方法进行不同目的研究,使这一领域的研究不断深入。但上述研究大都采Blaydes培养基的基本成分,少数用N6和SH培养基,往往程序较多,也较复杂。据上海植物生理研究所杨燮试验(1981)结果表明,MS培养基适用于苜蓿组织培养,但从诱导愈伤组织到分化再生出植株需7个月时间。所用培养基为lmg/12,4-D+MS和2mg/lKT+0.25mg/lIAA+MS。为提高培养效率,本试验采用MS无机盐和有机成分为基础加不同激素和蔗糖的处理方法,研究了苜蓿子叶再生植株的过程及不同基因型的影响。诱导愈伤组织的培养基分离、培养、保鲜、接种一、供试材料采用拉达克苜蓿为组织培养再生植株试验材料。参与子叶诱导愈伤组织和分化植株能力试验的品种计22个,包括沧县苜蓿、武功苜蓿、和田苜蓿、熊岳苜蓿、保定苜蓿、印地安苜蓿、猎人河苜蓿、秘鲁苜蓿、赤峰苜蓿、索伊H652苜蓿、克尼苜蓿、天津苜蓿、运城苜蓿、会宁苜蓿、安达瓦苜蓿、杜普梯苜蓿、切罗克苜蓿、拉达克苜蓿、Sirosal苜蓿、波兰杂种苜蓿、公农一号苜蓿和润布勒苜蓿等。这些品种除Sirosal是1983年从澳大利亚引进的原种外,其余均为本所1982年收获的种子。二、方法将供试种子经过精选后放入试管中,先用水浸泡2～4小时,再用70%的酒精浸渗10分钟,然后用10%的次氯酸钙或2%的次氯酸钠消毒20分钟,再用12%的过氧化氢消毒10分钟,最后用0.1%的氯化汞消毒8分钟,再用无菌水冲洗4次,然后接种于琼脂培养基中发芽,5天左右便可切取长出的展开子叶接种子愈伤组织诱导培养基中。用MS培养基为基本成分。根据试验目的,以此为基础对某些成分作适当的调整,分别配制成诱导和保持愈伤组织的培养基(CMS)、分化再生植株的培养基(DMS)、诱导根的培养基(RMS)。高压灭菌前以0.1N的HCl或KOH将培养基的pH调至5.8～6.0,然后将培养基分装在容量为50ml的三角瓶中,每瓶201m,加棉塞并以牛皮纸封口,然后用123℃高压灭菌消毒20分钟,在无菌室冷却凝固后即可接种。一般每30天继代一次,培养室温度为26±1℃,采用连续光照,以双管40瓦日光灯为光源,光强为3,000Lux。培养基的诱导诱导一、苜蓿组织培养的植株再生1.愈伤组织的诱导和保持研究表明,在紫花苜蓿愈伤组织培养系统中,脱分化和分化过程受生长素和细胞激动素调控。据Mitten等人研究,拉达克是一个出愈率和再生分化能力较好的品种。我们将无菌发芽形成的子叶每5片接种于一瓶培养基中,每块子叶重约4mg,每一处理接种50片,30天后记载出愈率和出愈的愈伤组织平均每块鲜重。结果表明(表2):(1)2,4-D对愈伤组织的诱导是必不可少的,而且在0～2mg/l范围内随其浓度增加,出愈率及其鲜重均相应增加。(2)出愈率高的往往鲜重也大。鲜重的提高是细胞生长的标志,说明适于诱导愈伤组织启动的营养成分同样对愈伤组织细胞的分裂和生长有利。(3)细胞激动素KT对出愈率和鲜重有抑制作用,尤其是对愈伤组织的起动有明显影响。观察表明,在没有KT而只有2mg/l2,4-D的培养基上,接种后第5天子叶切口的边缘开始膨大,形成愈伤组织;而在2mg/l2,4-D+2mg/lKT的培养基上第14天才能见到上述现象。由此可见,KT对诱导愈伤组织并非必需,反而有抑制效应。因此,确定2mg/l2,4-D+MS为诱导和保持愈伤组织听用的培养基(CMS)。该培养基具有诱导愈伤组织频率高、生长快的特点。拉达克苜蓿子叶在该培养基上第5天便可见到愈伤组织启动,第8天出愈率可达50%左右,第12天可达80%左右。2.植株的分化将CMS诱导培养30天的拉达克愈伤组织接种于除去2,4-D附加不同浓度KT和蔗糖组合的下列分化苗培养基中,每瓶接种5块愈伤组织,每一处理接种50块,中间继代一次,60天后分化苗的结果列于表3。从表3可以得出如下几点:(1)在没有蔗糖和KT的培养基中均未分化出植株。(2)4mg/lKT+20g/l蔗糖+MS是分化苗的最佳组合,因此,确定它为以后试验所用的分化苗培养基(DMS)。在该培养基上第18天就发现其中之一的愈伤组织,第一个开始出现鱼雷状突起一胚状体开始形成的过程。此外,整个试验过程发现,分化植株的过程是以胚状体形成的方式进行的,即首先从愈伤组织表面形成一种鱼雷状绿色突起,尔后逐步发育成肥壮的胚状体进而成苗。3.根的诱导采用不同浓度的NAA(萘乙酸)和蔗糖处理组合,将在DMS中分化出来的幼苗展开两片叶子时,从基部剪取接种于各处理水平的培养基中,每瓶3株,每一处理6株,观察记载最早开始形成根所需的天数和20天时生根幼苗的百分率(表4)。由表4可见:(1)在没有蔗糖和30g/l蔗糖的培养基中均未诱导出根,15g/l以上的蔗糖浓度对生根有抑制作用,虽然最终均100%地诱导出根,但与10g/l的蔗糖浓度相比,它们普遍晚几天出现根,因而10g/l的蔗糖浓度被认为是最理想的蔗糖水平。NAA对促进生根在一定浓度范围内是有效的,本试验中1.0g/l和2.Omg/l的浓度均表现出最佳水平。因此,确定1.0mg/lNAA+10g/l蔗糖为诱导根的培养基(RMS)。4.再生苗移栽试验在RMS培养基上诱导生根1个月时,一般每株幼苗均可长出5条以上健壮的根,这时便可移栽。先打开三角瓶塞在培养室锻炼1～2天,然后移到室温下再锻炼1～2天,再小心取出幼苗,将根部的培养基冲洗干净后可直接移栽到松软、湿润的花盆土壤中。为保持较湿润的条件,先将花盆用塑料薄膜罩住移至大田或温室中,3～5天后打开塑料薄膜,成活率可达80%以上。再生植株仍然保持原品种的特征特性,未发现变异,并在第二年5、6月份正常开花结实。至此,完成了从紫花苜蓿子叶愈伤组织的诱导至再生植株开花结实的全部过程。二、不同基因型品种的影响通过植物组织培养能否成功地再生植株,除培养基和培养条件是一个重要的因素外,另一个重要因素是材料的基因型。为了给今后的研究打下良好基础,选出的材料必须有出愈率高、生长快、再生分化能力强而又不易老化等优点。方法是:每个品种接种50片子叶,在CMS中诱导愈伤组织,30天时记载出愈率并测定其每块平均鲜重,然后将愈伤组织转移到DMS中进行分化苗试验,60天后记载愈伤组织中出苗的百分率。从表5可以说明:(1)不同基因型品种的子叶在诱导愈伤组织的能力上差异远不如分化苗能力的差异大。一般来说,不同的苜蓿品种子叶均可在适宜的培养基和培养条件下完成脱分化过程,但分化过程并非都能完成。其中有8个品种没有分化出苗,有待于进一步研究。(2)鲜重大、生长速度快的愈伤组织分化苗的能力是否高,尚不能定论。鲜重小的品种一般都是出愈较晚所致。如武功苜蓿和和田苜蓿等几个鲜重大的品种,接种后第4天子叶切口边缘便可膨大,开始启动和形成愈伤组织,而鲜重较小的品种,如猎人河苜蓿第7天才见到类似的现象。由此看出,武功苜蓿、和田苜蓿、拉达克苜蓿、保定苜蓿和运城苜蓿是出愈率和分化率较好的品种,至今已保持一年之久,仍有分化再生能力。植物激素的调节作用1.植物激素的调节作用紫花苜蓿组织培养再生植株的过程是分步完成的,各个阶段植物激素起了明显的调控作用。首先,在子叶诱导愈伤组织的阶段,2,4-D就起了关键的调控作用。根据周嫦等人的报道,2,4-D的作用首先是与生物体内含精氨酸高的粗蛋白结合而解除部分DNA的束缚,恢复转录(mRNA合成)和转译(酶的合成)的作用,从而启动细胞的分裂和生长,形成愈伤组织,KT第一阶段对愈伤组织抑制作用的原因尚不清楚。第二阶段中,由于2,4-D往往只有促进愈伤组织的形成和增殖,而抑制器官分化的作用,因而在分化苗过程中将它除去。KT在这一阶段起了关键的调控作用。麦克利恩等人认为,KT调节分化的作用可能是由于它影响了细胞内有活性的tRNA分子群所引起的。试验表明,NAA对诱导幼苗生根有一定的促进作用。总的来说,紫花苜蓿组织培养的器官分化过程是生长素和细胞激动素相互调节统一的结果,至于它们之间明确的作用界限,是一个很复杂的生理、生化机制问题,至今仍未彻底搞清。利用MS培养基对紫花苜蓿组织培养中植物激素之间调节作用的研究,至今还未见详细报道,本试验仅是一个初步探索。2.蔗糖的调节作用在分化幼苗和诱导生根过程中,可以发现蔗糖的调节作用。在紫花苜蓿组织培养的早期,可能是高水平的蔗糖作为碳源和能源启动了幼苗的分化,一旦分化开始,其本身就有可能加剧进行光合作用,为自身的生理、生化过程提供碳源和能源,而这时高水平的蔗糖则可能起了一种反馈效应,抑制了光合作用过程,从而也抑制了器官的分化过程。在生根过程中,蔗糖可能只作为一种渗透调节因素参与代谢。Brown等人对烟草组织培养过程中蔗糖的作用进行的研究提出,在器官分化过程中,