大孔吸附树脂纯化五指毛桃总黄酮的工艺研究

本科毕业论文（设计）题 目: 大孔吸附树脂纯化五指毛桃总黄酮的工艺研究 院 系： 贵阳学院化学与材料工程学院 专 业： 化 学 姓 名： 黄 鑫 学 号： 090701401054 指导教师： 冉 靓 教师职称： 讲 师 填写日期： 2013 年 1 月 18 日 贵阳学院毕业论文(设计)I摘 要目的 研究大孔吸附树脂纯化五指毛桃根总黄酮的最佳工艺。方法 选择 4 种不同大孔吸附树脂对五指毛桃根总黄酮进行静态和动态的吸附与解吸,考察原液的 pH 和洗脱剂乙醇浓度对五指毛桃根总黄酮纯化的影响。结果 AB-8 最适合于五指毛桃总黄酮的纯化, 最佳工艺为用原始 pH 的五指毛桃根提取液按 3.49mg 黄酮/g 树脂上样，用 2.52BV 体积蒸馏水洗脱，用 13BV 体积 75%乙醇作为洗脱剂进行洗脱。结论 用 AB-8 大孔吸附树脂分离纯化后,五指毛桃根总黄酮纯度可提高 6%以上。关键词:大孔吸附树脂; 五指毛桃; 总黄酮; 纯化贵阳学院毕业论文(设计)IIAbstractObjective To develop a method for the purification of total falconoid in root of Ficus hirta Vahl by macroporousresin with macro porous absorbing resin. Methods The concentration of total falconoids pH and eluting agent were in -vest gated by four kinds of macro porous resin. Results AB-8 was the most suitablemacroporous resin for the purification technology -gee of total falconoid in root of Pongamia pinnate. The impurities were removed by eluting with purified 2.52BV water. Then the part of eluting with 13 BV of 75% alcohol was collected. Conclusion The content of total fla-vonoids in root of Pongamia pinnate was up6% with the optimal purification process.Key words: Macro porous absorbing resin; Ficus hirta Vahl; Total flavones; Purification贵阳学院毕业论文(设计)III目 录1 前 言 11.1 五指毛桃的研究进展 11.2 黄酮类化合物研究进展 22 实验方法 32.1 实验仪器及试剂 32.1.1 试剂 32.1.2 仪器 32.2 五指毛桃总黄酮的制备及总黄酮的测定 32.2.1 五指毛桃总黄酮的制备 32.2.2 总黄酮的测定 42.3 树脂预处理及选型 42.3.1 树脂的预处理 42.3.2 静态吸附研究 42.3.3 静态解吸附研究 52.4 大孔树脂纯化条件研究 52.4.1 洗脱溶剂的选择 52.4.2 吸附 pH 选择 52.4.3 泄漏曲线绘制 52.4.4 动态吸附和解吸附实验 52.5 验证试验 53 实验结果及分析 6贵阳学院毕业论文(设计)IV3.1 五指毛桃总黄酮的制备及总黄酮的测定实验结果 63.2 树脂预处理及选型实验结果 63.3 大孔树脂纯化条件研究 73.4 验证试验结果 84 结 论 9参考文献 10致 谢 11贵阳学院毕业论文(设计)11 前 言1.1 五指毛桃研究进展五指毛桃又名南芪、五爪龙、五指牛奶、土北芪,为桑科植物粗叶榕Ficus hirta Vahl 的干燥根, 为岭南习用草药。分布于广东、广西、福建、云南、贵州等省区。它为稀有小乔木,生于海拔500-1000m的山地、林缘、灌丛及疏林中 1 。此外, 五指毛桃又是一食药同源的植物,在两广地区民间用于煲汤,称为“南芪” 2。在药理方面，临床上主要用于治疗脾虚浮肿、食少无力、肝炎、风湿痹痛、肺痨，具有健脾利湿、益肺止咳、舒筋通络的功效 3 。目前,对五指毛桃的研究主要集中在五指毛桃化学成分和药理方面 4，张云燕和钟森等人对五指毛桃进行研究并分离出黄酮类物质主要有：芹菜素、木犀草素和三甲氧基黄酮等黄酮类化合物 5 ，王伟伟和陈瑶2在对五指毛桃化学成分研究中指出五指毛桃含有二甲氧基黄酮、三甲氧基黄酮、四羟基黄酮和木犀草素等黄酮类化合物 6。五指毛桃药理作用有：第一，消化系统保护作用。蔡青圆等 7采用雄性ICR小鼠皮下注射盐酸可卡因染毒造肝损伤模，分别灌胃给予剂量分别相当于生药100，200，300 g/kg 的五指毛桃水煎剂，使可卡因染毒小鼠升高的丙氨酸转移酶、天冬氨酸转移酶及乳酸脱氢酶含量呈剂量相关性降低，明显减轻肝组织的病理改变。采用幽门结扎法，王艳等 8观察到五指毛桃水提液对幽门结扎大鼠胃酸分泌和胃蛋白酶活性无显著影响，但对胃黏膜表现出保护作用，激光多普勒仪观察到其对小鼠耳廓微循环具有显著改善作用，病理结果显示五指毛桃通过改善微循环对胃黏膜发挥保护作用。第二，平滑肌调节作用 9。利红宇等研究发现五指毛桃能显著减少枸橼酸喷雾引咳小鼠的咳嗽次数，增加小鼠气管酚红的排泄，对过度抑制状态的胃肠平滑肌有兴奋作用，对过度兴奋状态的胃肠平滑肌则有抑制的作用，加强和抑制小肠推进的双向作用，具有平滑肌双向调节功能; 而对气管平滑肌则表现出舒张的单向作用。第三，提高免疫功能。周添浓等对五指毛桃进行研究并指出它具有提高免疫功能 10。第四，抗氧化作用。曾茂贵 11等采用异丙肾上腺素致小鼠心肌缺氧模型，垂体后叶素加断头急性脑缺氧模型以及垂体后叶素致急性心肌缺血模型，发现五指毛桃水提液显著延长正常小鼠和异丙肾上腺素性心肌缺氧小鼠的耐缺氧时间; 明显延长垂体后叶素加断头致急性脑缺血模型小鼠张口喘息的时间，表现出较好的耐缺氧能力和抗氧化作用。第五，杀菌抗炎作用。五指毛桃水提液能抑制大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌的生长，能明显抑制二甲苯所致的耳肿胀及醋酸引起的腹腔毛细血管的增加，具有良好的抗炎镇痛作用 12。 贵阳学院毕业论文(设计)21.2 黄酮类化合物的研究进展 黄酮类化合物是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮结构的化合物。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态（苷元）的形式存在。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，黄酮类化合物具有广泛的药理活性 13，第一，黄酮类化合物对心血管系统活性。近年来黄酮类化合物的研究取得了很大的进步，目前临床治疗冠心病的有效中成药均含黄酮类化合物，如人工合成的去氧黄酮立可定(Recordil)对冠状血管有明显的扩张作用，并且能增加冠状动脉流量，如葛根素和灯盏花素等临床主要应用于对缺血性脑损伤的保护，如由银杏叶制成的舒血宁含有黄酮和双黄酮类化合物，可用于冠心病和心绞痛的治疗 14。第二黄酮类化合物抗炎、抗衰老和调节免疫活性。大多数研究都表明抗炎和免疫调节、抗衰老作用的活性是以黄酮类化合物的抗氧化活性为基础的15。第三，黄酮类化合物抗菌和抗病毒活性。大量文献表明，多数的类黄酮化合物对革兰氏阳性菌的抑制较明显大于对革兰氏阴性菌的，对于一些霉菌和酵母菌等真菌的抑制作用相对较弱。对于类黄酮化合物的抗菌作用机制学说有多种，例如：谢鹏等 16指出类酮化合物为多酚类化合物，可破坏细胞壁及细胞膜的完整性，从而抑制微生物的生长。第四，黄酮类化合物抗肿瘤活性。黄酮类化合物的抗肿瘤作用机制多种多样，包括抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞亡、干扰细胞信号传导和调节抑癌基因等 17。第五，黄酮类化合物抗氧化活性。研究表明黄酮类化合物中的2，3 双键、4 位羰基和3或者5位羟基对于其抗氧化活性有着重大贡献，黄酮类化合物的一些药理活性往往以其抗氧化自由基为基础，从植物中提取的黄酮类化合物具有较强的清除自由基的能力 18第六，抗辐射活性 19 。电辐射作用于生物体引起产生的自由基容易使细胞结构和功能的损坏, 黄酮类化合物因为具有抗自由基的作用因而具有抗辐射的能力。大孔吸附树脂为吸附和筛选相结合的分离材料，具有吸附快、吸附容量大、吸附选择性好、解吸条件温和、洗脱率高、物化稳定性高、不受无机物存在的影响、再生简单、使用周期长、易于构成闭路循环、节省费用等优点，特别适合工业化生产。在大孔吸附树脂纯化工艺研究中，有很多成功的例子，如赵映淑,董志和朱毅等用大孔吸附树脂纯化了水黄皮根总黄酮, 水黄皮根总黄酮浓度可达 50%以上 20 ；如冉靓，武子敬和冉阳等用大孔吸附树脂分离纯化板栗壳中总黄酮类物质,所得总黄酮含量达47.86%21。贵阳学院毕业论文(设计)32 实验方法2.1 实验仪器及试剂2.1.1 试剂五指毛桃 500g(广东天诚中药饮片有限公司)，吸附树脂：AB-8、D101、HPD600、HPD450（上海摩速科学器材有限公司） ，芦丁（中国药品生物制品检定所） ，50g/L 的 NaNO2 溶液，100g/L 的 Al(NO3)3 溶液，1mol/L 的 NaOH 溶液，95%乙醇， 萘酚，浓硫酸。2.1.2 仪器表 1 实验仪器实验仪器名称 型号 产地玻璃仪器气流烘干器旋转蒸发仪电热恒温水浴锅恒温振荡器循环水真空泵电子天平紫外分光光度计恒流泵KQ-CRE-85CHH-S78-1SH2-MP120-2752 HL-1巩义市予华仪器有限责任公司上海亚荣生化仪器厂北京科伟永兴仪器有限公司常州澳华仪器有限公司上海亚荣生化仪器厂成都天平仪器厂上海菁华科技仪器有限公司上海泸西分析仪器厂有限公司2.2 五指毛桃总黄酮的制备及总黄酮的测定2.2.1 五指毛桃总黄酮的制备取五指毛桃根粗粉 400g 用 70%乙醇溶液通过电热恒温水浴锅回流提取两次，2 小时每次，合并提取液，过滤，旋转蒸发回收乙醇后静置，备用。贵阳学院毕业论文(设计)42.2.2 总黄酮的测定 标准曲线的绘制 22,精密称取 26.3mg 芦丁用 60%乙醇溶解定容至 100ml，得浓度为263ug/ml 的标准溶液。分别取标准溶液 0.5、1.0、 1.5、2.0、2.5 ml 于 6 个具塞比色管中，加水至 5.0ml，加 0.50ml 50g/LNaNO3 溶液，摇匀，放置 6 分钟。加 0.50ml 100g/L Al(NO3)3溶液，摇匀，放置 6 分钟。加 4ml 1mol/L NaOH 溶液，加水至 10ml，放置 10 分钟后，在510nm 波长下测定吸光度，绘制标准曲线。提取液总黄酮测定：准确移取五指毛桃根总黄酮提取液，0.5ml，1ml，1.5ml和 2ml分别加入4个具塞比色管中，按照标准曲线绘制时的方法依次加入显色溶液，然后 ，于510 nm 波长下测定相应吸光度值，然后用标准曲线求解，从而求出提取液总黄酮含量。2.3 树脂预处理及选型 2.3.1 树脂的预处理 23 用 95%乙醇浸泡新的 AB-8、D101、HPD600、HPD450 树脂 24 小时，用大量纯化水洗净至中性，备用。2.3.2 静态吸附研究称取预处理好的湿重 AB-8、D101、HPD600 和 HPD450 大孔吸附树脂各 2 g 分别置于四个具塞三角瓶中，准确量取 20ml（总黄酮浓度为 0.7127mg/ml）提取液放入具塞三角瓶中，然后把三角瓶放在摇床上震荡 20h，测量三角瓶中剩余液中黄酮浓度，按下式计算各种树脂的吸附量和吸附率。吸附量（mg）=（原液总黄酮含量 原液体积吸附液总黄酮含量吸附液体积）吸附率（% ）= （原液总黄酮量吸附液总黄酮量）/ 原液总黄酮量100%2.3.3 静态解吸附的研究 将静态吸附后的树脂过滤、用适当的蒸馏水润洗抽干，置于具塞三角瓶中，加入 95%的乙醇溶液 20ml 解吸，将三角瓶放在摇床上震荡 20h，待充分解吸后，测定剩余液总黄酮浓度，按下式计算各种树脂的解吸附量和解吸率。解吸附量（mg）=解吸液总黄酮含量 解吸液体积解吸率（%）=解吸附量/吸附量100%贵阳学院毕业论文(设计)52.4 大孔树脂纯化条件研究2.4.1 洗脱溶剂的选择 称取预处理好的湿重 AB-8 各 2 g 分别置于三个具塞三角瓶中，准确量取 20ml 提取液放入三角瓶中，然后把三角瓶放在摇床上震荡 20h 后，按 2.3.2 中方法计算吸附率，然后分别用 95%、75% 和 55%的乙醇解吸，按 2.3.3 中方法计算解吸率。2.4.2 吸附 pH 选择 经过测量提取液的 pH 为 5，称取预处理好的湿重 AB-8 各 2 g 分别置于五个具塞三角瓶中，准确量取 20ml（总黄酮浓度为 0.8218mg/ml）提取液放入三角瓶中，调 pH 为1、3、5、7 和 9，然后把三角瓶放在摇床上震荡 20h 后，按 2.3.2 中方法计算吸附率。2.4.3 泄漏曲线的绘制 取静态吸附优选处理好的湿重 AB-8 树脂加入 1.520cm 层析柱中，树脂高度为 9cm即 15.89ml（11g 树脂） 。以 1-2ml/min 的流速上样（