超声波法提取山楂叶中总黄酮条件研究论文

本科生毕业设计（论文）题 目：超声波法提取山楂叶中总黄酮的条件研究学生姓名： 李友鹏 刘浩 刘高鹏 学 号： 院 系： 化学工程学院 专业年级： 2011 级应用化学 3 班 指导教师： 2015 年 6 月 12 日中国石油大学胜利学院本科毕业设计（论文）摘 要总黄酮是指黄酮类化合物，是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。山楂叶的化学成份复杂，从山楂叶中分离出的最多的功效组分是黄酮类物质。利用超声波法，以芦丁为参照品，硝酸铝作显色剂，在 510nm 波长以分光光度法测定总黄酮含量。结果测得工作曲线的回归方程为A=0.0091C+0.0023，r=0.9980 ，a=0.0023 ，b=0.0091 。线性相关系数 R=0.9980。采用单因素考察法对不同提取溶媒、乙醇浓度、温度、时间、料液比进行总黄酮含量的测定，得出较佳的实验条件为：乙醇的体积分数为 70%，料液比 1:20、超声温度 50，超声时间 60min，此时得到的黄酮质量为 137.555mg。通过四因素三水平的正交实验，得出影响总黄酮提取率的主要因素为乙醇浓度超声温度料液比超声时间。关键词：山楂叶；黄酮类化合物；超声波法；分光光度法中国石油大学胜利学院本科毕业设计（论文）ABSTRACTRefers to the total flavones, it is a kinds of natural products, widely exist in the plant kingdom, is many effective components of Chinese herbal medicine.Hawthorn complex chemical composition, isolated from hawthorn leaves most of the efficacy ingredient is flavonoids.This experiment using ultrasonic method，use Rutin as reference，Aluminum nitrate as chromogenic agent。The total content of flavonoids by spectrophotometry at the 510 wavelength.The results measured the regression equation of working curve for A=0.0091C+0.0023，r=0.9980 ，a=0.0023 ，b=0.0091 。The linear correlation coefficient R=0.9980.By the method of single factor investigation, different extraction solvent, ethanol concentration, temperature, time, and solid-liquid ratio to determine the content of total flavonoids.Then get the better experimental conditions for:The volume fraction of ethanol 70%, The material-water ratio1:20, Ultrasonic temperature 50,Ultrasonic time 60min, At this time of flavonoids content is 137.555mg.Through the four factors three levels orthogonal experiment get that the main factors influencing the flavonoids extraction rate is ethanol concentration ultrasonic temperature solid-liquid ratio ultrasonic time.Keywords：Hawthorn leaves; Flavonoids; Ultrasonic method; Spectrophotometry中国石油大学胜利学院本科毕业设计（论文）目 录第一章 绪论 .11.1 研究背景 .11.1.1 山楂叶的简介 .11.1.2 山楂叶中黄酮类化合物 .11.1.3 黄酮类化合物的研究现状 .31.2 山楂叶中总黄酮的提取方法 .41.2.1 水提法 .41.2.2 浸渍法 .41.2.3 微波提取法 .51.2.4 酶解法 .51.2.5 超临界流体萃取技术 .51.2.6 超声波法 .51.3 山楂叶中黄酮的测定方法 .61.3.1 分光光度法 .61.3.2 色谱法 .61.3.3 纸色谱法 .71.3.4 毛细管电泳法 .71.4 总黄酮类化合物应用前景 .71.4.1 抗心血管病药物 .71.4.2. 抗肝脏毒药物 .81.4.3 止咳平喘药 .81.4.4 天然抗氧化剂 .81.4.5 无公害农药 .81.4.6 在食品行业中的应用 .81.5 课题研究的目的、主要内容及其意义 .91.5.1 课题研究的目的 .91.5.2 课题研究的主要内容 .9中国石油大学胜利学院本科毕业设计（论文）1.5.3 课题研究的意义 .9第二章 实验部分 .112.1 实验原理 .112.2 实验仪器与试剂 .112.2.1 实验仪器 .112.2.2 实验试剂 .122.2.3 试剂的制备 .122.3 分光光度法测定山楂叶中总黄酮的含量 .122.3.1 芦丁对照品溶液的制备 30 .122.3.2 标准曲线的绘制 .122.3.3 山楂叶中黄酮含量的测定 .132.4 超声波提取工艺研究 .132.4.1 提取溶媒的选择 .132.4.2 超声波提取单因素试验 .142.4.3 正交试验 .142.5 精密度实验 .152.6 稳定性试验 .152.7 重复性实验 .15第三章 实验结果与讨论 .173.1 山楂叶中总黄酮含量的测定 .173.1.1 合适波长的选择 .173.1.2 芦丁标准曲线的绘制 .183.2 超声波提取工艺研究 .183.2.1 提取溶媒的选择试验结果与讨论 .183.3 超声波提取单因素实验 .193.3.1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响 .193.3.2 料液比对总黄酮提取率的影响 .203.3.3 提取时间对黄酮提取率的影响 .213.3.4 提取温度对总黄酮提取率的影响 .22中国石油大学胜利学院本科毕业设计（论文）3.4 超声波提取正交实验 .233.5 芦丁对照品精密度校准试验结果与讨论 .243.6 稳定性试验结果与讨论 .253.7 重复性试验结果与讨论 .26第四章 结 论 .27参考文献 .28致 谢 .31附录 A：开题报告 .32附录 B：文献综述 .38中国石油大学胜利学院本科毕业设计（论文）1第一章 绪论1.1 研究背景1.1.1 山楂叶的简介山楂叶，中药名。为蔷薇科植物山里红或山楂的干燥叶。夏、秋二季采收，晾干。分布于东北、华北等地。山楂是起源于我国的特产果树，有 3000 多年的栽培历史 1。山楂叶为山楂的干燥叶，含有多种化学成份，主要有黄酮和三萜两大类 2。国内自 20世纪 50 年代，就开始了对山楂叶的研究，随着中药提取和分析技术的现代化，山楂叶提取物的研究取得了很大的进展，其制剂益心酮片、胶囊、滴丸等已广泛应用于临床。药理及临床试验表明：山楂叶中黄酮类化合物具有降血压、调血脂、增加冠脉流量、改善心肌供血供氧等作用，对高血压、高血脂、冠心病及心绞痛等心血管疾病均具有显著疗效 3。此外，山楂叶黄酮还具有抗氧化 4、抑制肿瘤细胞增殖的作用 5。山楂叶最佳采收期应为 6 月中旬至 8 月初，在山楂叶黄酮含量的高峰期采集山楂叶，可充分利用资源，保证其收率和质量，提高利用价值。1.1.2 山楂叶中黄酮类化合物黄酮类化合物泛指两个苯环(A-环和 B-环)，通过中央三碳链相互链接，从而行成的系列 C6-C3-C6 化合物。主要指以 2-苯基色原酮为母核的化合物,其基本结构为：2-苯基色原酮。山楂叶的化学成份复杂，从山楂叶中分离出的最多的功效组分是黄酮类物质，黄酮类化合物是以黄酮(2-苯基色原酮)为母核而衍生的一类黄色色素，普遍存在于植物界中。山楂叶中的黄酮类化合物主要包括以下三大类：黄酮类、黄酮醇类和双氧黄酮类。山楂叶中黄酮类化合物的种类较多，其基本骨架是 2-苯基色原酮(见图 1-1)，不同之处是 3 号碳原子及苯环上取代基的种类和位置不同以及一吡酮环发生变化。山楂叶的抗氧化活性强弱与这些因素有关，只有分子结构满足一定条件时才能表现出较强的作用，其中最主要的是羟基化程度和羟基的位置，且一般认为 环中的邻二羰基起着主要作用，分子中酚羟基的数目或位置不同，彼此间的极性也不同，利用这一特性可以选择适当极性的溶剂系统来提取抗氧化活性较高的成分。中国石油大学胜利学院本科毕业设计（论文）2图 1-1 2-苯基色原酮(1) 消除自由基和抗氧化活性自由基是引起癌症、衰老、心血管等退变性疾病的罪恶之源。自由基在体内可直接或间接地发挥强氧化剂作用而与机体内核酸、核蛋白和脂肪酸相结合，转变成氧化物或过氧化物，使之丧失活性或变性，细胞功能发生障碍，引起机体逐渐衰老或病变。生物体内常见的自由基有：超氧阴离子自由基、羟基自由基、烷氧自由基等。王毕妮等 6的研究表明黄酮类化合物具有清除自由基和抗氧化活性的功能。研究显示：黄酮类化合物具有抑制自由基的生成、降低脂质过氧化 7和刺激抗氧化酶的作用，其作用机理在于它能有效阻止自由基在体内产生的三个阶段 8，即与超氧阴离子自由基反应阻止自由基引发；与金属离子螯合阻止OH 的生成；与脂质过氧化基反应阻止脂质过氧化过程。(2) 对酒精中毒的解毒作用和治疗酒依赖的作用酒的主要成分乙醇在代谢过程中产生大量乙醛，具有较强的毒性。进入人体内的乙醇大部分在十二指肠和空肠吸收，在体内代谢过程中产生过量的自由基，对生物膜造成严重的损伤，现代医学研究表明，酒精中毒可以引起 NADH/NAD 比值增高，造成肝脏纤维化或坏死，凋亡小体出现，乙醇脱氢酶改变等。大豆异黄酮对急性酒精中毒小鼠实验表明具有较好的解毒和抗氧化保护作用，能够拮抗乙醇对中枢神经的抑制作用，延长小鼠耐受酒精的时间；促进乙醇分解，降低血液乙醇浓度，加速乙醇的排泄；清除代谢过程中过量的自由基，保护肝细胞免受自由基亲电子化合物和毒物的损害 9。(3) 防癌抗癌作用Hussein 等先后预测和发现了黄酮类化合物具有防癌抗癌作用。黄酮类化合物主要通过三种途径来达到防癌、抗癌的作用。即抗自由基作用、直接抑制癌细胞生长和抗致癌因子等 10。物理化学等致癌因子导致自由基在体内富集，引起脂质过氧化，破中国石油大学胜利学院本科毕业设计（论文）3坏细胞的 DNA 从而引发癌症。黄酮类化合物是自由基猝灭剂和抗氧化剂，能有效地阻止脂质过氧化引起的细胞破坏，起到防癌、抗癌的作用 11。(4) 抗肿瘤作用黄酮类化合物的抗菌和抗病毒作用已得到医学界的肯定，其抗肿瘤作用主要是通过诱导细胞凋亡、促进抗肿瘤细胞增殖、干预细胞信号转导和促进抑癌基因表达等途径来实现 12。尽管黄酮类化合物发挥抗肿瘤活性时，均有 A 环与受体的负电荷中心结合、C 环与受体的正电荷中心结合、其它部分通过氢键与受体发生作用的共性 13，但因其苯环上取代基的不同而具有不同的抗肿瘤活性。如以不同糖基取代时，其抗肿瘤、抗氧化作用效果的差别就会很大。(5) 抗心血管疾病黄酮类化合物具有抗心血管疾病的功能美国食品与药物管理局(FDA)于 1999 年10 月就已将大豆异黄酮中的大豆蛋白推荐为降低血液中胆固醇浓度，以减少患心血管疾病危险的健康食品 14。研究表明，黄酮类化合物可治疗心脑血管系统的一些疾病，有降血脂、胆固醇的作用，还具有抑制血栓和扩张冠状动脉等作用。可用于治疗高血压、动脉硬化。(6) 抗骨质疏松 黄酮类化合物可以用于治疗骨病和骨质疏松等症。其作用机理在于 15：其一，它既可以抑制前列腺素 E2(PGE2)的胶原蛋白合成增加，又能抑制 PGE2 的胶原蛋白合成减少，通过调节使其含量趋于平衡。因此可以用于治疗骨病；其次，它能提高甲状腺对雌激素的敏感性，使甲状腺 C 细胞分泌降钙素的作用加强，最终抑制骨再吸收而治疗骨质疏松症；其三，它还能抑制饮食中缺钙和维生素 D 引起的骨密度和骨钙含量的降低 16。1.1.3 黄酮类化合物的研究现状祖国大陆山楂叶的应用研究始于 20 世纪，70 年代至 80 年代中期进入了比较系统的基础性研究。从 90 年代初至今在山楂叶应用方面取得了长足的进展。研究表明山楂叶中的活性物质主要为黄酮类化合物。王秉极 17等采用硅胶柱色谱分离和旋转色谱分离，从北京山楂叶中分离一系列成分并进行了鉴定，分别是 5,7-二羟基黄酮(柯因)、3,5,7-羟基黄酮、5,7- 二羟基-2- 甲氧基黄酮、二十三烷酸甲酯、邻苯二甲酸(2-乙基苯中国石油大学胜利学院本科毕业设计（论文）4基)酯和癸二酸(2-乙基苯基)酯。迟家平等对辽宁西部产山楂叶进行了全面的研究，其中用加压硅胶柱层析等方法分离，并用核磁共振、质谱、红外、紫外等方法鉴定，从辽西山楂叶中分离出其中黄酮类化合物。周立东 18等分离鉴定了北京山楂叶中的黄酮类成分，通过硅胶和聚酞胺柱分离，葡聚糖柱层析纯化，用核磁共振、质谱、红外、紫外和园二色谱等方法确定分离物结构，结果从北京山楂叶中分离到六种黄酮类化合物，分别是球松素、松属素、柯因、抽木柯因、良姜素和高良姜素，其中首次从北京山楂叶中发现球松素、松属素、袖木柯因、良姜素。王小平 19等建立了分光光度法测定山楂叶中总黄酮含量，并对该方法进行了方法学考察。薛晓丽 20将超临界 CO2 流体提取工艺与传统的乙醇浸出提取工艺相比较，得出两种方法都有利于山楂叶有效