淀粉酶酶学性质的研究

生 物 化 学 学 号 ：淀 粉 酶 酶 学 性 质 的 研 究学生姓名：#指导教师：#所在院系：生命科学学院所学专业：#学号：# 大 学中国哈尔滨2011 年 12 月淀粉酶酶学性质研究1摘要：酶是酶是一种生物催化剂，它具有催化剂属性，同是也具有一些无机催化剂所不具有的特性。催化特定化学反应的蛋白质、RNA 或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。本实验通过利用淀粉酶水解还原糖，还原糖能使 3，5-二硝基水杨酸还原，生成棕色的 3-氨基-5 硝基水杨酸。淀粉酶活力与还原糖的量成正比，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位质量样品在一定时间内生成还原糖的量表示酶活力。酶的活性又同时受到温度、PH、激活剂抑制剂等的影响。关键词：淀粉酶 活力 温度 PH 激活剂和抑制剂前言：淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。淀粉酶的种类很多，根据织物不同，设备组合不同，工艺流程也不同，目前所用的退浆方法有浸渍法、堆置法、卷染法、连续洗等，由于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少，可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜明的环保特色。此 酶 以 Ca2+为 必 需 因 子 并 作 为 稳 定 因 子 和 激 活 因 子 ， 也 有 部 分 淀 粉 酶为 非 Ca2+依 赖 型 。 淀 粉 酶 既 作 用 于 直 链 淀 粉 ， 亦 作 用 于 支 链 淀 粉 ， 无 差 别地 随 机 切 断 糖 链 内 部 的 1， 4-链 。 因 此 ， 其 特 征 是 引 起 底 物 溶 液 粘 度 的急 剧 下 降 和 碘 反 应 的 消 失 ， 最 终 产 物 在 分 解 直 链 淀 粉 时 以 葡 萄 糖 为 主 ， 此外 ， 还 有 少 量 麦 芽 三 糖 及 麦 芽 糖 ， 其 中 真 菌 a-淀 粉 酶 水 解 淀 粉 的 终 产 物 主要 以 麦 芽 糖 为 主 且 不 含 大 分 子 极 限 糊 精 ， 在 烘 焙 业 和 麦 芽 糖 制 造 业 具 有 广 泛的 应 用 。 另 一 方 面 在 分 解 支 链 淀 粉 时 ， 除 麦 芽 糖 、 葡 萄 糖 、 麦 芽 三 糖 外 ， 还生 成 分 支 部 分 具 有 -1， 6-键 的 -极 限 糊 精 （ 又 称 -糊 精 ） 。 一 般 分 解 限 度以 葡 萄 糖 为 准 是 35-50%， 但 在 细 菌 的 淀 粉 酶 中 ， 亦 有 呈 现 高 达 70%分 解 限度 的 （ 最 终 游 离 出 葡 萄 糖 ） 。通 过 研 究 淀 粉 酶 的 性 质 ， 能 使 我 们 更 好 的 了 解 它 ， 并 充 分 利 用 于 工 业 生产 、 食 品 加 工 、 医 疗 等 产 业 。淀粉酶酶学性质研究21 材料与方法1.1 材料萌发的小麦种子（芽长约 1cm）1.2 主要实验仪器及试剂离心机 分光光度计 容量瓶 研钵 电炉 恒温水浴 离心管标准麦芽糖溶液（1mg/ml） 3，5-二硝基水杨酸0.1 mol/l 的柠檬酸缓冲液1% 淀粉溶液等1.3 方法 1.3.1 芽糖标准曲线的制作取 6 支干净的具塞刻度试管，编号，按表 13-1 加入试剂表 13-1 麦芽糖标准曲线制作管号 1 2 3 4 5 6麦芽糖标准液/ml 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0蒸馏水/ml 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0麦芽糖含量/ml 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.03,5-二硝基水杨酸/ml 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0光密度值 0 0.038 0.103 0.166 0.231 0.299摇匀，置沸水浴煮沸 5 分钟。取出后流水冷却，加蒸馏水定容只 20ml. 以 1 号管作为空白调零点，在 540nm 波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度纵坐标，绘制标准曲线。实验数据的记录如表 13-2麦芽糖含量 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2光密度值 0 0.036 0.1 0.161 0.226 0.283表 13-2 实验数据标准曲线绘制如图 13-3淀粉酶酶学性质研究3标 准 曲 线y = 0.1461x - 0.0118R2 = 0.9949-0.0500.050.10.150.20.250.30 1 2 3光 密 度 值线 性 (光 密 度 值 )图 13-3 标准曲线1.3.2 粉酶液的制备称取 1g 萌发 3d 的小麦种子（芽长约 1cm） ，置于研钵中，加少量石英砂和 2ml蒸馏水，研磨匀浆，用 6ml 蒸馏水粉刺将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取 1516 min , 每隔数分钟搅拌一次，使其充分提取。然后在 3000 r/min 转速下离心 10min ，将上清液倒入 100ml 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于淀粉酶活性的测定。1.3.3 活力的测定取 8 支干净试管，编号，按表 13-4 加入试剂 表 13-4 酶活力的测定项目 总淀粉酶活性的测定试管号 II-1 II-2 II-3 II-4淀粉酶原液（ml） 0 0 0 0钝化-淀粉酶 置于 70水浴中 15min,冷却酶稀释液 (ml) 1.0 1.0 1.0 1.0预保温 将各试管和淀粉溶液置于 40水浴中保温 10minPH5.6 缓冲液（ml） 1.0 1.0 1.0 1.00.4mol/LNaoH(ml) 4.0 0 0 01%淀粉（ml） 2.0 2.0 2.0 2.0保温 在 40恒温水浴中 5min0.4mol/L NaoH(ml) 0 4.0 4.0 4.0将各试管摇匀，分别取 2ml 放入 25ml 刻度管中，再加入 2mlDNS 试剂混匀沸水浴煮沸 5min 取出冷却，再用蒸馏水稀释至 25ml 混匀，在分光光度计上 540nm处进行比色，测定光密度值，记录测定结果。原始数据记录：淀粉酶酶学性质研究4编号 II-1 II-2 II-3 II-4光密度值 0.017 0.193 0.175 0.194结果计算：查表得： B=1.4052 B=0.1971(+)-淀粉酶活性=(1.405-0.1971)825850/2.052=2946.591.3.4 淀粉酶学性质研究1.3.4.1 淀粉粉酶液的制备称取 2g 萌发 3d 的小麦种子(芽长约 1cm)，置于研钵中，加少量石英砂和 2ml蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入刻度试管中，定容至 25ml.提取液在室温下放置提取 15-20min, 每隔数分钟搅动一次，使其充分提取。然后在 4000r/min转速下离心，将上清液倒入一个干净的试管中，即为淀粉酶液。1.3.4.2 温度对淀粉酶活性的影响取 10 支试管，编号，按表 13-5 加入试剂，并记录观察到的结果表 13-5 温度对淀粉酶活性的影响管号 A a B b C c D d E e缓冲（PH=5.6） 1 - 1 - 1 - 1 - 1 -淀粉溶液/ml 2.5 - 2.5 - 2.5 - 2.5 - 2.5 -淀粉酶提取/ml - 1 - 1 - 1 - 1 - 1预保温 10min 4 室温 40 沸水浴 沸水浴混合 A 倒入 a B 倒入 b C 倒入 c D 倒入 d E 倒入 e酶促反（10min） 4 室温 40 沸水浴碘液 各 3 滴显色 蓝色 无色 无色 无色 蓝色1.3.4.3 PH 对淀粉酶活性的影响取三支试管，编号，按表 13-6 记录观察到的颜色淀粉酶酶学性质研究5表 13-6 PH 对淀粉酶活性的影响I II III缓冲液/ml 2（PH=3.0） 2（PH=5.6） 2（PH=8.0）淀粉溶液/ml 各 2.5淀粉提取液/ml 各 1酶促反应（10min） 摇匀，40水浴 10min碘液 各 3 滴显色 浅蓝色 无色 浅蓝色1.3.4.4 激活剂和抑制剂对酶活性的影响取四支试管，编号，按表 13-7 操作，并记录观察到的颜色表 13-7 活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响I II III缓冲液/ml（ph=5.6）各 2mlNaCL 1 - -CuSO4 - 1 -H2O - - 1淀粉溶液 各 2.5ml酶提取液 各 1ml酶促反应 混匀，4010min碘液 各 1 滴显色 无色 浅蓝色 无色2.实验现象：2.1 温度对淀粉酶活性的影响如图 2-1图 2-1 温度对淀粉酶活性的影响淀粉酶的最适温度为 40左右，但在实验过程中蓝色过一段时间会消失，可能是因为蓝色络合物不稳定，因而会消失在 4时酶的活性低，淀粉未被分解或分解的少，显蓝色，而在 100时淀粉结构被破坏。2.2 PH 对淀粉酶活性的影响如图 2-2淀粉酶酶学性质研究6图 2-2 PH 对淀粉酶活性的影响在 PH 为 3.6 时因为生成的络合物不稳定，所以蓝色很快消失呈无色现象，在 PH 为 5、6 时一直无颜色变化，此时时淀粉酶最适 PH2.3 激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响如图 2-3图 2-3 激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响硫酸铜为抑制剂，铜离子使其活性降低，从而有淡蓝色现象，而氯化钠为激活剂氯离子使淀粉酶活性增强，无颜色变化标准液的测定时，比色时，读取光密度至少要2-3次求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差；标准曲线绘制时，一般光密度浓度标准曲线，一般应至少二次或三次以上的平行测定，重复性好的曲线方可使用。根据实验数据分析，萌发的小麦中淀粉酶的活性很强，2946.酶催化活性受温度的影响很大。在本实验中温度为40时，表现最好，淀粉完全水解。确定酶的最适温度为40。淀粉酶之所以受温度影响，因为其本质是蛋白质，在低温时影响较慢，随着温度的升高，酶的活性也随之加快，当达到最是温度时，酶反应速度达到最快，以后又随着温度升高而逐渐减慢，以至完全停止。在低温时，酶的活性虽然低，但是酶依然有活性，是可逆过程。淀粉酶酶学性质研究7当经高温后，酶由于结构发生改变，是不可逆过程。在测量一种酶的活性时，通常是在最适温度下进行的。然而，一种酶的最适温度也不是完全固定的，它与作用时间的长短有关。因此，要确定酶的最适温度，需要多次测量。酶的活性受pH的影响尤为显著。pH过高或者过低都会影响酶的活性。实验条件下，pH为5.6时淀粉酶的活性表现的最好，- 淀粉酶3.6以下迅速钝化。- 淀粉酶的最适pH 有一定的影响, 会改变其最适作用范围。酶的活性往往还受到激活剂和抑制剂的影响。大多数激活剂和抑制剂都不能改变淀粉酶的性质。抑制剂多与酶的活