植物中SOD的分离提取及性质研究VIP

植物中 SOD的分离提取及性质研究生物化学综合实验报告1实验课程：生物化学综合试验实验项目：植物中 SOD的分离提取及 性质研究指导老师：袁怀波实验日期：2012.6.24-6.30开课实验室：生物基础实验室教学班级：生物工程 10-2班一实验目的SOD 广泛存在于生物界，是防御氧毒害的关键酶。SOD 主要有CuZn-、Mn-、Fe-SOD 三种类型同工酶，它们共同的生物学作用是专一地清除生物氧化中产生的超氧阴离子自由基（对细胞组分及细胞器，尤其是生物膜有严重的损伤作用） ，具有抗衰老、抗辐射、抗癌等生理作用。在医药中，SOD 可用于治疗辐射病、自身免疫性疾病、植物中 SOD的分离提取及性质研究生物化学综合实验报告2炎症等；在食品中，可用于保健食品添加剂；在化妆品中，可防止皮肤衰老、抗炎、防晒等作用。植物中大蒜的 SOD 含量丰富，所以，本实验研究大蒜中 SOD 的性质，并确定 SOD 同工酶类型。二实验原理（一）SOD 的性质超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称 SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。SOD 金属蛋白酶，对 pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为 3 种：铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)和铁超氧化物歧化酶(FeSOD)。SOD 催化如本实验中 SOD 取自大蒜 并且引用邻苯三酚自氧化方法测定其活力的方法。邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化 释放出 O2- 生成带色的中间产物 反应开始后反应液先变成黄棕色 几分钟后变成绿色 几小时后又变成黄色 这是生成中间产物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段 中间物的积累在滞留 30-45S 后与时间成线性关系 一般时间维持在 4min 内 中间物在 420nm 波长处有强烈的光吸收。当有 SOD 存在时 由于他能催化 O2-与 H+结合生成 O2 和 H2O2,从而阻止了中间产物的积累 因此 通过计算即可求出 SOD 的活性。 植物中 SOD的分离提取及性质研究生物化学综合实验报告3酶活力单位定义 在 25恒温条件下 每毫升反应液中 每分钟抑制邻苯三氛自氧化率达 50%的酶量定义为一个酶活力单位。三材料与方法1、试剂 PH7.80.05mol/l 磷酸盐缓冲溶液 （参照附录 1） 2、氯仿-无水乙醇混合液 以 3：5 体积比混合 3、PH8.2 50mmol/l Tris-HCL 参照附录 II 4、10mmol/l HCL ,SOD 样液； 5、50mmol/l 邻苯三氛 称取邻苯三氛 0.063g,用 10mmol/lHCL 溶液溶解 定容至 10ml,避光保存。 6、2.4510-3mol/l 氮蓝四唑NBT: 称 200mgNBT 使其溶于去离子水中并定容至 100ml 置棕色试剂瓶中 避光 4保存。由于 NBT 溶液用量较多 且 NBT 价格贵 每次使用后妥善保存 可反复使用多次。当黄色 NBT 溶液颜色变浅或变绿并出现沉淀时则不能继续使用 应重新配制。 7、3.610-2mol/l PH7.8 磷酸钠缓冲溶液 内含 2810 -2 mol/l 四甲基乙二胺(TEMED)、2810-5 mol/l 核黄素 在 100ml3.610-2mol/l PH7.8磷酸钠缓冲溶液 配制参考附录 I 中含 0.42mlTEMED 及 1.32mg 核黄素。至棕色瓶中4 保存。 8、冷丙酮 30% 双氧水40% 蔗糖溶液 内含 0.1%溴酚蓝,Tris,TEMED,Acr,Bis, 核黄素。植物中 SOD的分离提取及性质研究生物化学综合实验报告42.实验仪器移液管、离心机 5000r/min,量筒、烧杯、研钵、玻璃棒、微量移液器、试管、分光光度计、1cm 比色皿、恒温水浴槽、电泳槽、电泳仪、培养皿、4*108 日光灯、容量瓶、烧杯、冰箱等3.实验内容（ 1）大蒜粗酶液的提取 提取：称 4g 左右的大蒜至于研钵（事先冷藏）中，使细胞破碎，再加入 5ml 0.05mol/l PH7.8 的磷酸盐缓冲溶液（事先冷藏） ，继续淹没搅拌 15min，使 SOD 充分溶解到缓冲液中，然后 5000r/min,离心 10min，弃去沉淀，得提取液。 取出杂蛋白：提取物加入 2 倍体积的氯仿-无水乙醇混合溶剂，搅拌 15min，5000r/min 离心10min,取出杂蛋白，得粗酶液。 植物中 SOD的分离提取及性质研究生物化学综合实验报告5沉淀 SOD：将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌 15min,使SOD 凝聚，5000r/min 离心 10min，得 SOD 沉淀溶于 2ml PH7.8 的磷酸盐缓冲溶液中。 热击处理： 把提抽原液注入已编号的试管然后将试管置入恒温水槽，温度设置为 60 热击 20min. 高速离心去杂 取上层清液。稀释 5 倍 待用。 （2）.SOD 性质的研究 邻苯三氛自氧化法测定 SOD 的酶活性： 邻苯三氛自氧化速率的测定 取两支试管按表 1 加入 25预热过的缓冲液，然后加入预热过的邻苯三氛（空白管用 10mmol/l HCL代替邻苯三氛） ，迅速摇匀，立即倾入 1cm 比色皿中，在 325nm 波长处测定光吸收值 每隔 30s 读数一次，测定 4min 内每分钟光吸收值的变化，得出每分钟的自氧化速率。 （可增减邻苯三氛自的加入量以控制光吸收值）SOD 样液活性的测定 样品管取代自氧化管（表 2） 。样品管测定时先加入预热的待测植物中 SOD的分离提取及性质研究生物化学综合实验报告6酶液，再加邻苯三氛。其余步骤同邻苯三氛自氧化速率的测定。酶活性的计算：酶活性=(自氧化速率-样液速率)/自氧化速率)*(100%)/(50%)*反应液总体积*样液稀释倍数/样液体积 根据上述 SOD 酶活性的测定方法测定在不同 PH 下、不同温度下、激活剂和抑制剂下求出酶活性。做出酶活性和不同 PH 曲线、酶活性与温度曲线、以及在抑制剂条件下酶活力的大小。 不同 PH 对酶活力的影响：首先按下表加入 PH 分别为 7.1 的 25预热过的缓冲液，注意加入预热过的邻苯三氛，迅速摇匀，立即倾入 1cm 比色皿中，在 325nm波长处测定光吸收值，每 隔 30s 读数一次，测定 4min 内每分钟光吸收值的变化，记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。改变PH 分别为 7.7,8.2,8.6,9.0，记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。植物中 SOD的分离提取及性质研究生物化学综合实验报告7不同温度对酶活力的影响: 首先取试管按下表加入 0的缓冲液，然后加入相同温度下的邻苯三氛，迅速摇匀，立即倾入 1cm 比色皿中，在 325nm 波长处测定光吸收值，每隔 30s 读数一次，测定 4min内每分钟光吸收值的变化。记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。改变温度分别为 25,50,75,100。记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。抑制剂的影响：按下表 25预热过的液体，最后加入预热过的邻苯三氛，迅速摇匀，立即倾入 1cm 比色皿中，在 325nm 波长处测定光吸收值，每隔 30s读数一次，测定 4min 内每分钟光吸收值的变化，记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。与不加抑制剂的相比较得出结论。植物中 SOD的分离提取及性质研究生物化学综合实验报告8（3）.PAGE 定位染色法鉴定同工酶的类型1.配胶植物中 SOD的分离提取及性质研究生物化学综合实验报告9按配方在模具中灌注分离胶后，小心的在分离胶的表面加一层水（或水饱和的异丙醇或正丁醇） ，封住胶面，以促使聚合并使凝胶表面垂直。凝胶在 30-40放置约 40 分钟-1 小时后，可以看到一个界面，表示凝胶聚合。吸水（或水饱和的异丙醇或正丁醇） ，用浓缩胶缓冲液贮液淋洗凝胶，然后灌注浓缩胶。并插入与模具大小相同，与凝胶厚度相当的梳子。为防止气泡陷入，梳子应倾斜插入。然后让模具再静止放置在 30-40，聚合约 40 分钟-1 小时（注意在分离胶和浓缩胶聚合时，应用日光灯照射以促使凝胶凝聚） 、加样 按下表加入试剂，充分振荡，使醇液与变性剂均匀混合。 （Mn-SOD 的活性受氯仿 乙醇的影响，cuznSOD 和 Fe-SOD 这两种同工酶均对 H2O2 酶感，cusOD 对KCN 酶感，MnSO D 不受 CN 的影响）植物中 SOD的分离提取及性质研究生物化学综合实验报告10待各管溶液配置好后，分别取 10ul 加入凝胶的 3 个齿上。、电泳 SOD 同工酶的分离采用不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳。连接电源，调节电流至 15mA,带样品由浓缩胶进入分离胶时，再将电流调至 20-30mA，当染料前言距离凝胶边缘 1-2cm 时，关闭电源，电泳结束。 、染色 SOD 活性染色 取凝胶板，采用 SOD 负染色方法，按以下次序浸泡于培养皿中染色 (1)在 24510 3mol/l 氮蓝四唑(NBT)黑暗下