外周血染色体标本制作

外周血染色体标本制作一、染色体标本制备原理 在细胞遗传学研究中，为了使细胞质透明，离解胞间层，使组织软化，且使染色体彼此铺展开而又能清楚地显示缢痕，往往需要对正在分裂或已经收获的细胞作一系列预处理。有时，在对细胞进行固定的时候，为了使固定剂迅速渗透到组织中，以便于研究染色体的特殊结构，也需要作预处理；其目的是使细胞的核外条件及染色体本身的状态更适于分析和研究的需要。在细胞培养（培养基中加有 PHA）后 72小时，合成 DNA的细胞占总数的 45，有丝分裂的速率相当于每小时 1%，被激活的淋巴细胞占总数的 90%，是收获分裂期细胞、制备染色体标本的最佳时期。从收获到制片需经过加纺锤体抑制剂、低渗处理、固定、滴片等几个主要环节，现将各步骤的原理、所用试剂及相关注意事项详述如下。 1 纺锤体抑制剂 1.1基本原理和机制 使染色体散开并清楚地呈现次缢痕，凭借的原理是改变细胞质的粘度。因为在细胞分裂时，随着纺锤体的形成，染色体紧靠在一起，很难进行分析。纺锤体的形成取决于细胞质和纺锤体成分的粘度之间的平衡。因此，改变细胞质的粘度就能破坏纺锤体，使染色体依然呈游离状态，或者更确切地说，染色体不再粘附至细胞内的任何结合力上。所以在随后制作标本时一旦受到压力，染色体就很易铺展开来。同时，由于染色体的不同区段上水合作用的能力不一，当细胞质的粘度发生变化时，就会使缢痕区显示得更为清楚。1 纺锤体抑制剂细胞分裂中纺锤体是由微管组成的。微管管壁由 13条原丝纵向平行排列构成，主要成分为微管蛋白，而微管蛋白分 微管蛋白和 微管蛋白两种。 微管蛋白和 微管蛋白组成的异二聚体构成微管亚单位，若干个异二聚体相接连成原丝。 微管蛋白与 微管蛋白在化学结构上极为相似，两者 42%序列相同。其中 微管蛋白肽链中第 201位为半胱氨酸，为秋水仙素结合部位。如果结合的部位被其结合，微管不仅不能继续聚合，而且会引起原有微管解聚。 1 纺锤体抑制剂故秋水仙素具有干扰微管装配，破坏纺锤体形成和终止细胞分裂的作用。以秋水仙素为代表的纺锤体抑制剂能引起有丝分裂过程中纺锤丝断裂或抑制纺锤体的形成，但不影响染色体的复制和着丝粒的分裂使正在分裂的细胞停留在中期，以获得大量分裂相供分析之用。秋水仙素积累分裂中期的作用，几乎对所有植物器官和许多动物的器官都是十分有效的。 1 纺锤体抑制剂1.2主要的纺锤体抑制剂及其作用特点 秋水仙素 秋水仙素（ colchicine）是一种生物碱，因最初从百合科植物秋水仙（ Colchicum autumnale）中提取出来，故名。分子式 C22H25O6N。纯秋水仙素呈黄色针状结晶，熔点157 。易溶于水、乙醇和氯仿，难溶于热水、乙醚等。味苦，有毒。秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分裂，称为秋水仙素有丝分裂（ C-mitosis）。在这样的有丝分裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而使染色体加倍。1 纺锤体抑制剂秋水仙素的作用与其浓度和作用时间相关，在高浓度时可以延缓着丝点分裂，低浓度时则抑制细胞纺锤体的形成。 在秋水仙素作用下，染色单体缩短，着色变深以致外形清晰。但不同染色体缩短的程度不一，长的染色体比短的染色体浓缩得更明显些。从能收集到足够的中期细胞考虑，秋水仙素处理的时间宜长些，所用的浓度宜高些；但从能得到较为细长的染色体考虑，处理的时间宜短，所用的浓度宜低。因而秋水仙素处理的方法应同时兼顾这二个方面。如果处理的时间太短则标本中的分裂细胞就少；与此相反，如果处理的时间太长分裂细胞虽多，但染色体缩得太短，以致形态模糊，就难以获得优良的显带标本。 1 纺锤体抑制剂 与其它预处理化学物相比较秋水仙素的另一个优点是，在广泛的温度范围内都是有活性的。在热带地区的夏季，那怕气温高达 43.3 ，对秋水仙素的活性也无显著影响，有人将秋水仙素加入保存在 89 的组织中，发现中期细胞的数目比保存在室温但未加秋水仙素的组织要多得多，而且染色体的结构也很清楚。 乙酰甲基秋水仙碱是人工合成的秋水仙素的衍生物。它的功能跟秋水仙素一样但对细胞的毒害作用只有秋水仙素的1 30一 1 40。 4610-6的浓度即可得到所希望的效应。 除了秋水仙素以外，另一些化学物也可作为纺锤体抑制剂。如三氯乙醛水合物、六六六、硫酸长春花碱等，它们在人体细胞均可产生良好效果。1 纺锤体抑制剂1.3处理过程培养终止前在培养基中加入浓度为 20g/ml的秋水仙素 0.050.1ml（ 1ml注射器滴垂直 3-5滴）使其最终浓度为0.40.8g/ml，置 5%CO2、 37C0.5C培养箱中处理24h。1 纺锤体抑制剂1.4注意事项应当注意的是经秋水仙素处理后的细胞虽可用各种不同的固定液 (金属固定液或非金属固定液 )予以固定，但一定要在固定之前把秋水仙素从组织或细胞上冲洗掉，否则沉积在细胞表面的秋水仙素不仅会影响染色体的形态，而且还会阻碍固定液的穿透性。为此，在低渗处理后，应尽早地加快速穿透液，如甲醇 冰醋酸固定液。要不然在固定的时候，细胞核仍可能进入代谢期。2低渗溶液 经过秋水仙素处理后，细胞内的染色体比较适合于观察了，但还是不能满足要求。因为人类细胞的染色体数目多，形状小，最大的染色体约 78微米，加之主要的观察与分析均在油镜下进行，这就要求标本中的染色体彼此散开，并且尽可能处于同一平面上。这些均有赖于低渗处理。 2低渗溶液2.1基本原理和机制 1965徐道觉发现未作低渗处理时，伴随染色体的一些零乱的物质类似于核糖核蛋白体的颗粒，显然是有丝分裂中核仁崩溃时的残存物。而低渗处理后，这些物质就消失了。可见，低渗处理不只是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，而且还可使粘附于染色体的核仁物质散开，这样就能看清楚每一个扭曲的染色体。现在知道，覆盖在染色体上的核仁物质大大地阻碍着染色体的分散。2低渗溶液2.2主要的低渗液 低渗溶液是指渗透压和离子强度均低的溶液。可以是水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾 (0.65mol L)、氯化钾 (0.075mol L)、稀释的平衡盐溶液或培养基。处理时间一般为 840分钟，处理时的温度为 2337 。 在早期的一些研究中，大多用柠檬酸钠或柠檬酸钾作为低渗液。也有些学者主张用稀释的人血清，认为这样可使染色体的形态特征更为清晰。自 1965年后，人们改用 KCl为低渗掖。其优点是染色体的轮廓清楚，可染色性增强，染色时间短。在相差显微镜下观察 KCl低渗处理标本的效果比其它低渗液更好些，也适合于显微分光光度分析，当用显带染色时能充分显示带型的特点。 KCl的浓度以0.075mol L为宜，但不同组织所需的处理时间未必相同。2低渗溶液2.3低渗处理过程秋水仙素处理 2-4小时后，小心地从温箱取出培养瓶，用滴管将培养液转移到 10ml离心管并置离心机内离心，转速为 1500rpm，离心 10min。离心后用滴管吸弃上清液，培养物沉积在管底。然后加入 37温育的低渗液 8毫升，用滴管吹打成单个细胞悬液，置 37C水浴处理 20-30min，使红细胞破碎，白细胞膨胀。 2低渗溶液2.4影响低渗效果的因素 影响低渗处理的效果是以下三个因素：低渗溶液的化学组成、低渗的强度和处理的时间。处理时间太短则染色体铺展不好，处理时间过长会引起细胞破裂甚至由于染色体胀得太大而致形态结构模糊。因此，在实际操作中，对某一种组织究竟应选用哪一种低渗溶液，需事先进行预试验。3 固定 固定是组织、细胞或其成分选择性地固定于某一特定阶段的过程。其目的是杀死细胞但又要避免所研究的成分受到破坏。不同物种对固定剂的反应是不一的，哺乳类动物染色体的固定尤其需要特定的方法，这是因为每种生物的细胞质成分彼此各异的缘故。生物类型本身的复杂性及多细胞生物中细胞内的变化较大，以致很难在细胞水平上分析固定的效应。 3 固定3.1基本原理与机制 用于固定的化学物对细胞都具有杀死作用，这类化学物可分成二大类：一类能使染色体固缩，或使核酸和蛋白质纤丝相脱离，另一类则可维持染色体结构的完整性。 为使染色体结构不受破坏，提高染色体的可见性及嗜碱性，就需要使染色质物质沉淀。在活体条件下，细胞内不同成分之间的相差并不足以使它们成为一种明显的单位。可是随着蛋白质的凝结和沉淀，染色体的折射系数将发生很大的变化从而使它们在细胞内成为明显的小体。正因为如此，迄今所用的固定剂都具有交链蛋白质的特性，都能使染色质沉淀。尽管常用的染色体固定剂往往是数种化学物的混合物，但其中至少有一种化学物必须具备这一特性。3 固定固定剂的另一重要特性是能迅速地穿透组织或细胞，并在 瞬间内杀死它们，这样方能使正在分裂的细胞立即阻留在各自的时相上。瞬间杀死是很重要的，否则核分裂仍可继续下去并到达所谓的 “休止相 ”或 “代谢相 ”，那就无从研究染色体了。3 固定可是，随着细胞的死亡而出现的另一些变化 (特别是蛋白质的自溶作用 )，往往会破坏染色体的原来结构。在正常情况下，细胞内的酶参与蛋白质的合成，而当细胞死亡时，由于介质变为酸性，这些酶便在相反方向起作用，即使复合蛋白质裂解为简单的氨基酸。因为多肽是染色体的主要成分之一，所以这种变性效应最终将引起染色体结构的破坏。因此，作为一种固定剂也应能防止蛋白质的自溶作用。此外，在细胞致死的同时，细菌的活动致使细胞内成分的分解。因此一种好的固定剂应当既能起到防腐作用，又能阻止细菌的分解作用。3 固定 最后，理想的固定剂还应能有助于达到优良的染色效果，即能增强染色体的嗜碱性。例如，甲醛虽具有优良固定剂的其它所有特性，但却会降低染色体的嗜碱性，所以不能单独用作染色体的固定剂。 显而易见，没有哪一种化学物能同时具备以上这些条件，因而通常是将数种可以共存的液体混合起来，使之成为染色体研究中真正有效的固定剂。尽管如此，那怕是最佳固定剂仍难免有不足之处。首先，细胞被杀死后发生的基本变化很难予以避免；其次，可能会抽提出一些弥散成分；最后即使操作十分谨慎，仍难以保持酶活性不变；此外，某些化学物还会导致细胞的皱缩。3 固定细胞的膨胀和染色体的皱缩是决定固定剂质量的两个重要因素。以往曾认为渗透压是促使细胞内结构膨胀或破坏的决定性因索，为此选用等渗液作为固定剂，其实这种看法是不正确的。事实证明，稀释的醋酸具有 20个大气压，照常可使细胞和组织膨胀，而只有 2.5个大气压的苦味酸却可使组织大大地收缩。这提示一种固定剂的效果如何与渗透压的关系很小。另一方面，苦味酸使蛋白质沉淀的作用很强而醋酸却没有这一作用。可见，使蛋白质沉淀这一特性在导致染色体收缩方面可能起重要作用。因此，在选用哪些化学物作为固定剂时，需要权衡以上这些因素。3 固定 用作固定剂的化学物有非金属和金属两类。前者如乙醇，甲醇、醋酸、甲醛、丙酸、苦味酸和氯仿等。后者如铬酸、锇酸、氯化铂、氯化汞、硝酸铀等。其中有几种化学物还可作为蒸气固定剂，也即在接触水或其它溶剂之前使可溶性物质先转变为不溶性物质，这样就可在原位制作标本。 在细胞化学研究上，大多数非金属固定剂 (除甲醛外 )比之于金属固定剂有一优点是，在固定之后无需在水中冲洗标本。3 固定3.2固定液的种类 醋酸 作为混合固定液的一种成分，醋酸的优点在于：（ 1）可以与已知的任何一种固定剂同时使用，并且可以和任意比例的水、乙醇或甲醇混合；（ 2）浓度可以很低（ 1%）也可以很高（ 99%）；（ 3）具有很强的穿透性能，比乙醇的穿透性还高。 醋酸能使核酸沉淀使组蛋白溶解，但却不能固定细胞质蛋白。在染色体结构的研究中，醋酸的主要用途是阻止染色体收缩，使染色体的结构免于被破坏。经醋酸固定的物质还能抵销乙醇的硬化作用。3 固定 醋酸是染色体的一种理想的固定剂，它可使染色体结构保持完整，且多半不致破坏核蛋白。这种固定剂的一个缺点是会导致染色体片段的过分膨胀，因此如果要研究染色体的详细结构，必须把它与乙醇或类似的化学物一道使用，后者能使组织收缩和硬化。在研究减数分裂的染色体时，如果目的是了解染色体的行为，而不是其结构细节，用醋酸作为固定剂当然是十分恰当的。在分析粗线期的染色体时要求染色体的细节清晰，醋酸也不愧是一种理想的固定剂。 此外，醋酸还是苯胺类染料的一种优良溶剂。正因为具有这一特性，它是染料和固定液混合物中必需的一种成分，例如醋酸 洋红、醋酸 奥辛和醋酸 间苯二酚蓝等。3 固定 甲醇 在植物染色体研究中极少应用，可是却广泛地用于动物染色体的固定。甲醇是从木材分解蒸馏制得的，是焦木酸的一种成分。虽然乙醇会使染色体收缩得很厉害，而甲醇却可使染色体膨胀。在制备固定液时往往需要一种膨胀剂以补偿另一些化学品的收缩效应，所以甲醇这一特性是非常有用的。它的有效浓度为 70至 100。它是一种无色有毒的液体且可以任何比例与水混合。但不能与氧化剂一道，否则很快会氧化成甲酸。 3 固定 乙醇 广泛地用作染色体固定剂的一种成分。它的有效浓度与甲醇一样。乙醇有一个最重要的优点是能迅速地穿透人组织。它可以沉淀蛋白质，还具有脱水性可使蛋白质出现不可逆转的变性，还能使组织硬化。 作为一种还原剂，在有氧化剂存在时乙醇会很快被氧化为乙酸。所以它不能与许多金属固定剂 (铬酸或四氯化锇 )相混用。乙醇不能有效地固定染色质，原则上不能与醋酸、甲醛或氯仿混合使用。可是冷的乙醇固定法往往能保存某些酶，因为酶的反应基团 般是不受它破坏的。在对染色体的酶进行研究时，宜用 80冷乙醇固定 1小时或更多时间；如用于单层培养物，往往以纯乙醇或 95的乙醇固定1-15分钟为宜。3 固定 卡诺固定液。 卡诺固定液由 1份冰醋酸和 3份甲醇或乙醇混合而成。这种固定液适用于所有的动植物和人类染色体的固定。固定的时间为 15分钟到 24小时，温度为室温或稍冷。必要时可以改变酸和醇的比例，例如改成 1:2或 1:4等。随着醋酸比例的增高，固定液膨胀的效能加大，有利于染色体的铺展；但是如果控制不当则会导致细胞破碎，反而不利于分析。 卡诺固定液的一个缺点是经这种方式固定的组织不能被许多碱性染料的水溶液染上色，除非用一些特殊的媒染剂。这是因为固定液中缺乏有助于染色体嗜碱性的金属成分