次级淋巴组织趋化因子的基因克

目 录 中文摘要 -3 英文摘要 -6 第一部分： 人次级淋巴组织趋化因子（SLC）的基因克隆及在大肠杆菌内表达 第一部分 成熟人 SLC 基因克隆及序列分析 前言 -10 材料 -10 方法 -11 结果与讨论 -16 小结-18 附图-19 第二部分 人 SLC 在大肠杆菌中的表达及重组蛋白的鉴定 前言 -23 材料 -23 方法 -24 结果 -28 讨论 -29 小结 -29 附图-30 第三部分 小鼠次级淋巴组织趋化因子(SLC)基因的克隆、瞬时 表达及抗肿瘤作用初步研究 前言 -35 材料 -35 方法 -36 结果-37 讨论 -40 小结 -41 附图-42 论文总结- 参考文献- 发表论文与综述- 致谢- 次级淋巴组织趋化因子的基因克隆表达 及抗肿瘤作用研究 专 业 免疫学 研究生 董忠军 导 师 赵跃然 中 文 摘 要 一 立题依据和目的 次级淋巴组织趋化因子 SLC (Secondary Lymphoid tissue Chemokine ) 又称 6CKine 、Exodus2 和 TCA(Thymus-derived Chemokine Agent4)，是由 Nagira 等 1997 年用信号序列捕获(signal sequence trap)法寻找趋化因子同源序列时在人 EST 文库里克隆出的新的 CC 趋化因子。几年研究表明 SLC 对多种免疫细胞特别是对 T 细胞具有趋化作用，其趋化的归宿主要为次级淋巴组织或器官，因而 SLC 被认为是第一个参与体内淋巴细胞归巢( Lymphocyte homing )的趋化因子。无论是重组 SLC 蛋白瘤内注射还是基因转染肿瘤细胞或树突状细胞， SLC均有显著的抗肿瘤作用，所以是一种较有发展潜力的抗肿瘤药物。目前，国内外实验研究用 SLC 均来自杆状病毒表达产品，我国已有在大肠杆菌融合表达 SLC 的报道，由于目前还没有杆状病毒表达产品上市供人使用，且融合蛋白也不可用于人体等原因，我们试图通过高效表达载体 pBV220 实现 SLC 在大肠杆菌内非融合表达，用于 SLC 的生物学作用的研究。 肿瘤免疫治疗的方法主要是利用免疫刺激细胞因子、协同分子和一些免疫细胞，但是，这些方法均表现局限的抗肿瘤反应，特异性的抗肿瘤反应需要吸引大量的效应细胞到抗原呈递部位，趋化因子在这种免疫反应中发挥重要作用。Sharma,-S 等首次使用重组 SLC 注射到 3LL 肺癌细胞系荷瘤小鼠瘤内，40%肿瘤完全消退，且在肿瘤局部和全身检测到系统性和局部免疫反应，包括 CD4T 细胞、CD8T 细胞和树突状细胞明显上升，并伴有 Th1 类细胞因子上调，而免疫抑制细胞因子 IL-10 显著下降，体外检测肿瘤局部浸润的淋巴细胞细胞毒活性明显增强，SCID 小鼠以及 CD4、CD8 基因敲除小鼠没有观察到 SLC 抗肿瘤活性，表明 T 细胞在 SLC 抗肿瘤效应中发挥主导作用，到目前还没有证实 NK 是否参与 SLC 抗肿瘤的报道，不过有人已经证实 NK 参与 ELC 的抗肿瘤作用，基于 ELC 和 SLC 的诸多相同点，且 NK 也表达 SLC 受体(CCR7),推测 NK 很可能参与抗肿瘤效应。 二 方法和结果 1. 人 SLC 成熟肽的基因克隆及在大肠杆菌中的重组表达 取正常人淋巴结，用本室制备的 RNA 提取试剂盒分离纯化细胞总 RNA。以 RNA模板，随机六聚体核苷酸为引物，在 M-MLV 逆转录酶的作用下进行反应，合成cDNA 的第一链。根据 GeneBank 报道的 SLC 的编码序列，设计扩增成熟 SLC 基因的上、下游引物，分别在 5，端加上限制性酶切位点 EcoRI 和 BamHI。设计上游引物时，在成熟 SLC 编码序列的上游加上起始密码子 ATG,同时在上游加上保护性碱基 TA,下游加上 AA，降低 G+C 含量，防止二级结构的形成，提高重组蛋白质的表达含量。以 RT 反应物为模板，用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR，扩增 SLC 基因。用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化 PCR 扩增产物后，与 pMD18-T 载体连接，转化大肠杆菌，接种含 100ug/ml 氨苄青霉素的 LB 平板。用菌落 PCR 和限制性酶谱分析筛选出阳性克隆，采用 ABI100 全自动 DNA 测序仪测序，结果显示，克隆的基因和预期的成熟人 SLC 基因完全一致，成功构建了 SLC 重组质粒 pMD18-hSLC。 用 EcoRI 和 BamHI 双酶切消化重组质粒 pMD18-hSLC，低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化 SLC 片断，插入原核表达载体 pBV220 的 PL 启动子的下游，构建重组SLC 表达载体。重组子同样用菌落 PCR 和限制性酶谱分析筛选出阳性克隆，从而获得重组阳性质粒 pBV220-hSLC。含有 pBV220-SLC 的大肠杆菌（工程菌株）接种于含 100ug/ml 氨苄青霉素的 LB 液体培养基，30振荡培养至对数生长期，42诱导 4 小时，离心收集细菌，进行 SDS-PAGE 和 Western blotting 分析。结果显示，重组蛋白的表观分子量约 18KD，和文献报道一致，凝胶图像分析表明重组蛋白约占菌体总蛋白的 20。Western blotting 分析，重组蛋白能和抗人 SLC 抗体特异性反应，说明重组蛋白为人 SLC。 为研究重组 SLC 的生物学活性，进行小规模的发酵。工程菌以 1：100 接种于含有葡萄糖和甘油的 LB 培养基中， 30振荡培养至 OD 值约 04-0.5，迅速转移至40水浴摇床又到 4 小时。4离心收集细菌，洗涤，超声破碎。7000rpm 离心洗涤，分离包含体。沉淀用含 0.2%的 TritonX-100 洗涤 3 次，纯化包含体。用 8M 尿素溶解包含体，然后用凝胶过滤初步纯化目的蛋白，SDS-PAGE 分析显示，获得蛋白纯度约 90%。 2、小鼠趋化因子 SLC 的抗肿瘤作用研究 为了探讨 SLC 的抗肿瘤作用机制，特别是 NK 细胞在 SLC 抗肿瘤作用中所发挥的作用，我们用同样的方法从小鼠脾脏成功克隆并构建了带有信号肽序列的重组 pMD18-mSLC，序列测定表明所克隆的 SLC 基因与 Nakano,H 报道的亮氨酸突变体一致。用 Hind和 BamHI 双酶切消化重组质粒 pMD18-mSLC，低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化 SLC 片断，插入真核表达载体 pCDNA 的 CMV 启动子的下游，构建哺乳细胞表达载体 pCDNA- mSLC。脂质体法转染猴肾细胞 COS-7，Western blotting 分析证实，细胞上清中可检测到可溶性的 SLC，提示构建的重组表达载体 pCDNA- mSLC 可用于黑色素瘤细胞的基因修饰，并可用于 SLC 的基因治疗的实验研究。将纯化的 pCDNA- mSLC 质粒和适量的脂质体混合后，转染 70%融合生长的小鼠黑色素瘤细胞系（B16） ，经 G418 筛选后，用 PCR 和 Western blotting 分析 SLC 的分泌表达水平，结果提示，基因修饰的 B16 细胞可表达小鼠 SLC。大量培养扩增阳性克隆细胞，背部接种 C57BL/6 小鼠，观察肿瘤大小和存活率,结果显示，基因修饰的 B16 细胞致瘤性下降，小鼠存活率延长。 三 结论 1. 成功克隆了人成熟 SLC 基因，序列分析显示，克隆的基因序列和文献报道一致。 2. 构建了成熟 SLC 的原核表达载体，获得稳定表达的工程菌株，重组蛋白约占菌体总蛋白的 20%。 3. 初步摸索优化了重组 SLC 的表达条件，包含体提取步骤，初步纯化工艺。 4. 成功克隆了小鼠 SLC 基因，序列分析与 Nakano,H 报道的亮氨酸突变体一致。构建了分泌型表达载体，并实现了瞬时表达。 5. 成功完成小鼠黑色素瘤细胞系（B16）的基因修饰，修饰后的肿瘤细胞致瘤性下降，小鼠存活率延长。 关键词：SLC; 克隆；表达；抗肿瘤 英文摘要： Cloning And Expression Of Human Secondary Lymphoid Tissue Chemokine And Study On Its Antitumor Responses Background Secondary lymphoid tissue chemokine (SLC, also referred to as Exodus 2 or 6Ckine) is a recently identified high endothelial-derived CC chemokine by searching the Expressed Sequence Tag (EST) database. For many years several studies have revealed SLC can be chemoattractant for many immune cells and especially T lymphocyte to lymphoid tissues or organs. So SLC was considered to be the first chemokine participating lymphocyte homing. With further studies researchers have discovered SLC play a significant role in the antitumor through recombinant SLC injection or SLC-modified tumor cells or SLC-modified dentric cells. Therefore, SLC may be a potential candidate drug for the cancer. Up to now most experimental SLC was Bac-to-Bac product, which cant be used in vivo. We are going to produce SLC encoded by an efficient vector PBV220 in the E. coli for the study of its biological activities. Various attempts at anti-cancer immunotherapy have used immunostimulatory cytokines, accessory molecules or tumor antigen-loaded dendritic cells. However, all these trials have exhibited only a limited anti-tumor response. A specific anti-tumor response should be enhanced by attracting to the site of antigen presentation large numbers of cells capable of eliciting an effector function on presentation and activation by tumor antigen. Chemokines play an important role in specific immune response. Intratumoral injection of recombinant SLC evidenced potent antitumor responses and led to complete tumor eradication in 40% of treated mice. SLC-mediated antitumor responses are associated with local and systemic immune responses including CD4 and CD8 T lymphocytes and dendritic cells infiltrating and the enhanced elaboration of Th1 cytokines and chemokines monokine induced by IFN-gamma and IFN-gamma-inducible protein 10 but a concomitant decrease in immunosuppressive cytokines at the tumor site. There were no evidences supporting NK cell participating the SLC-mediated. While NK cells were confirmed to be one of effector cells in the antitumor responses mediated by ELC, a CC chemokine like SLC. On the basis of their similarity and CCR7, a SLC receptor, on the NK cells, it is suggested that NK cells take part in these responses. Methods and results 1. Cloning and expression of secondary lymphoid tissue chemokine in the E.coli Total RNA was isolated from human normal lymph node with RNA extraction kit made in our lab. The first stand of c DNA synthesized with random 6mer prime in the presence of M-MLV reverse transcriptase. According to the sequence of SLC for the mature human SLC in the Gene bank, a pair of primes, P1 and P2, was designed. Restriction site of EcoRI and BamHI were added to the upstream of forward and reverse primers respectively. The start codon ATG was put right on the upstream of the mature SLC gene. In addition, two protective nucleotides TA and AA respectively were added before the pairs avoiding secondary structure of RNA， decreasing the Gcontent, enhancing the productivity. The reverse transcript was used to amplified human SLC cDNA with Taq DNA polymerase. PCR product was separated with low-melting agrose gel electrophoresis. The purified PCR product was ligated with pMD18-T vector and then transformed the competent E.coli. The positive clones were primary screened with colony PCR and restriction map analysis. Using reverse and forward primers the positive clones were sequenced with ABI100 DNA sequencer. Our results showed that the cloned cDNA sequence was similar to that reported. Therefore, the recombinant SLC vector, pMD18-hSLC, has been successful constructed. To generate the recombinant prokaryotic expression vector, pMD18-hSLC were digested with two restriction enzymes EcoRI and BamHI. The purified SLC fragment was inserted into the pBV220 digested with same enzymes under the control of PL promoter. The recombinants were selected with colony PCR and restriction map analysis and positive clones pBV220-SLC were obtained. The bacterium harboring pBV220-SLC was grown to early log phase in LB medium containing Amp (100ug/ml) at 30. Expression of the recombinant SLC was induced at 42 for 2-4 hours. The cells were collected by centrifugation at 4 4000rpm for 5 minutes. The pellet was suspended in 2X SDS-PAGE sample buffer and then boiled for 5 minutes. The SDS-PAGE of the bacterium lysate shown that there was an additional band that seemed to be about 18KD identified with previously reported recombinant SLC expressed in E.coli. The protein accounts for about 20% of the whole bacterium protein. Using Western blotting analysis, the recombinant polyclonal SLC could specifically react with anti-SLC antibody. To study the biological activities of SLC, we perform a small-scale fermentation. The engineered strain was added to LB medium containing glucose and glycol in the proportion of 1:100 and incubated at 30 until OD550 about 0.4-0.5. The culture was rapidly removed to incubation bed and continued to shake at 42 for 4 hours. After Centrifugation at 4,the pellet was harvested and washed with solution A and solution B respectively and lyased with supersonic wave. The lyased bacterium was centrifuged at 7000rpm and washed with solution C containing 0.2% TritonX-100 for three times to get body inclusion. The body inclusion was dissolved in 8M urea solution. With gel filtration the recombinant SLC was primarily purified. SDS-PAGE analysis revealed that the purity of SLC was about 90% . 2. The Study On The Antitumor Responses Of Secondary Lymphoid Tissue Chemokine (SLC) To explore the mechanisms of the antitumor responses of secondary lymphoid tissue chemokine, especially the roles of NK cells in the antitumor response, we have successfully cloned, with previous methods, the full-length SLC gene from murine spleen and constructed the recombinant pMD18-mSLC containing SLC signal peptide sequence. After sequenced, the cloned SLC gene was identified with the mutant reported by Nakano, H. after the pMD18-mSLC vector was digested with two enzymes, Hind and BamHI the SLC fragment was isolated with low-melting gel agrose electrophoresis and inserted into the downstream of CMV promoter of pCDNA, a eucaryotic vector and recombinant pCDNA-mSLC was obtained. Then the plasmid was transfected into COS-7 cells by the lipfectAMINE. The soluble SLC could be detected and confirmed by Western blotting analysis, indicating the expression vector could be used to modify the B16 cells. The purified pCDNA-mSLC was transfected to the B16 cells. After selected by G418, the clones were identified with RT-PCR and Western blotting. The gene-modified B16 cells were cultured, harvested and injected on the back of C57BL/6 mice, while control groups were injected with pCDNA-modified B16 cells and B16 cells. Observe the size of tumor and the survival rate. Subsequent results revealed that decrease of SLC-modified B16 cells in the tumourgenity occurred and the survival rate increased. Conclusion Using recombinant DNA technique, we have been successfully cloned human SLC gene from lymph node. Its DNA sequence was similar to that reported. 1. The recombinant prokaryotic expression vector (pBV220-SLC) containing human mature SLC has been obtained and can express in the stable manner. The recombinant SLC can account for 20% of the whole protein of E.coli. 2. Some methods involved in the recombinant SLC expression and body exclusion preparation and purification have been investigated and optioned. 3. We have also cloned the murine SLC gene with full length from the C57BL/6 mice spleen. The DNA sequence was same as a mutant reported by Nakano, H. the recombinant eucaryotic vector with signal peptide sequence can express in the COS-7 cells in the transient manner. 4. The SLC-modified B16 cells have decreased tumourgenity and mice loaded with the SLC-modified B16 cells have longer life than pCDNA-modified B16. Key words: Chemokine; secondary lymphoid tissue chemokine (SLC); cloning; expression; antitumor . 第一部分 成熟人 SLC 的基因克隆基序列分析 前 言 趋化因子专指一组小分子量的细胞因子，通常为 810KD。根据氨基端前两个保守的半胱氨酸的排列顺序不同而分为:CC 趋化因子（ 趋化因子） 、CXC 趋化因子（ 趋化因子） 、C 趋化因子（ 趋化因子）和 CX3C 趋化因子（ 趋化因子）四大类。次级淋巴组织趋化因子(SLC)又称 6CKine、TCA-4，是年通过信号序列捕获（Signal Sequence Trap）在 EST 文库中发现的新的 CC 趋化因子。几年研究表明，SLC 的组织分布主要是外周淋巴组织或器官如脾脏、淋巴结、阑尾和派氏集结等。它的主要生物学活性是趋化体内多种淋巴细胞（包括 T 细胞、B 细胞、树突状细胞和 NK 细胞）到外周淋巴组织或器官，因而曾被认为是第一个参与淋巴归巢的趋化因子。外周淋巴组织是接触抗原、抗原致敏和免疫应答的主要部位，SLC 的表达将会招募免疫应答细胞到局部，从而在免疫应答和免疫调节中发挥重要作用。国外已开展 SLC 在肿瘤、慢性感染性疾病及过敏性疾病等方面的应用研究,Sharma 将小鼠 SLC 注射到结肠癌肿瘤局部后 40%的肿瘤消退，若与 IL-2 或 GM-SCF 联合使用肿瘤 100%消退。基于 SLC 蛋白在理论及实际应用中的作用，我们克隆了人成熟 SLC cDNA 分子，用于今后开展进一步研究。 材 料 一 分子生物学试剂 1.工具酶：所用内切酶 EcoRI、BamHI 和反转录酶 M-MLV 为 GIBCO 产品，Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶购自大连宝生物公司（TAKARA 产品）氨苄青霉素、随机六聚体引物、蛋白胨、酵母提取物、盐酸胍、异硫氰酸胍、MgCl2、0.1M DTT 2.载体及菌株 大肠杆菌 DH5a 本室长期保存，pMD18-T 载体购自大连宝生物有限公司。 1. RNA 提取试剂盒由本室赵跃然研究院提供 2. 质粒 DNA 快速提取试剂盒（本室赵跃然教授研制） P1: Tris-HCl （ pH 8.0） ， 100P2: 200 mM NaOH ， 1% SDS P3: 3.0M KAC （pH5.5） 树脂:Silica(矿石， Sigma 公司产品) washing buffer 丙酮 5. 其它试剂： DNA Marker dNTP 二 生物化学试剂:琼脂糖、NaCl、溴化乙锭、甲醛、甘油、Tris-Cl 等国产货进口分析纯试剂 三 淋巴结组织：取自正常外科病人淋巴结，由山东省立医院提供。 四 仪器设备 苏州净化设备厂超级工作台，恒温摇床，上海医用恒温设备厂产恒温培养箱，PCR 仪：PTC-150 美国 MJ Research 公司产品、ZDJ-多功能紫外透射仪：上海顾村电光仪器厂、超低温冰箱：SANYO、微量移液器：法国 Glison 公司产品、电泳仪：BDF-1600 型双稳电泳仪，北京东方仪器厂 BeckmanDU530 可见/紫外分光光度计方法 方 法 一 引物设计及合成 根据文献报道和 genebank 上人 SLC 基因序列及大肠杆菌偏性密码自取用特性设计，由上海生工生物有限公司合成，首先用 vector NTI 软件对 SLC 全长基因进行酶切位点分析，方便以后的酶学操作。在所分析的酶中常用的位点有 HindIII 和PstI（见附录 1） 。所以酶切位点避免有这两种位点。上游引物 P1 含人成熟 SLC（去处其信号肽序列）基因上游的第 120 位核苷酸，其中第 9 位的 C 分别同义突变为 G,并在上游加入 ATG EcoRI 位点，下游引物引入 BamHI 位点。引物序列如下： mRNA GGCATCCCCAGGACCCAAGG P1 5 TAGAATTCTTATGGGCATCCCGAGGACCCAAGG P2 5 AAGGATCCAGGCTGCTCACTGGGC。 二 淋巴结组织总 RNA 的提取 1. 0.5g 淋巴结组织加 0.5ml 变性液，在玻璃匀浆器中将其匀浆。 2. 将匀浆移入 1.5mlEP 管中，加入 50ul PH4.0 的乙酸钠缓冲液，混匀；加入0.5ml 水饱和酚，混匀，再加入 100ul 的氯仿。混匀后 4放置 15 分钟 3. 15000rpm 4离心 20 分钟，将上层水相移入一个 1.5mlEP 管中，加入等量异丙醇-20 放置 60 分钟沉淀 RNA，4 离心 15000rpm，10 分钟。 4. 将 RNA 溶解于 0.3ml 变性液中，加 0.3ml 异丙醇-20放置 60 分钟，沉淀 RNA4 离心 15000rpm，10 分钟。 5. 重悬 RNA 沉淀于 70%乙醇中，悬起沉淀，室温放置 10 分钟，15000rpm，5 分钟。 6. 室温干燥，溶解于 80ulDEPC 高压水。甲醛变性琼脂糖凝胶点泳鉴定 RNA 的纯度。 三 甲醛变性琼脂糖凝胶点泳 电泳槽清洁处理后，浸泡于 3% H2O2 溶液中，室温放置 10 分钟，然后用80ulDEPC 高压水彻底冲洗，将 4.5ulRNA 与 5x MOPS 缓冲液 2ul,甲醛 3.5ul 及 甲酰胺 10.0ul 混合，65变性 15 分钟，迅速置于冰浴冷却；然后制备 1%甲醛变性琼脂糖凝胶：按甲醛溶液：琼脂糖水溶液：5x MOPS 缓冲液 = 11.：3.5：1.1 的比例配制。先将琼脂糖、三蒸水及 5x MOPS 缓冲液于微波炉中加热至完全溶解，待温度降至 60 左右时，加入甲醛，轻轻混匀后铺胶；以 1x MOPS 缓冲液为电泳缓冲液，5v/cm 预电泳 5 分钟；上样，7v/cm 预电泳 45 分钟；紫外灯下观察结果并拍照。 四 成熟人 SLC 基因的扩增及分离 1. cDNA 的合成(RT 反应) 逆转录反应体系包括(20ul): 随机引物 1ul (500ng/ul) 总 RNA 4ul (1ng5ug) dNTP 1ul (10mM) DEPC 高压水 7ul 65水浴 5min 后迅速放置冰上，离心收集液体，然后加入 5firststrand buffer 4ul 01M DTT 2ul 37 2min 后再加入 MMLV 1ul 37 50 min 7015 min 灭活 MMLV 2. PCR 反应：反应体系包括(100ul): 10 PCR buffer 10ul 25mM MgCl2 6ul 10mM dNTP 2ul p1 1ul (20uM) p2 1ul(20uM) RT 产物 4ul Taq DNA 聚合酶 1ul(1ug/ul) 轻轻混匀后加入 100ul 石蜡油封住反应上层， 95 5 min 预变性，变性 95 1 min 退火 58 1 min 运行 30 个 循环， 延伸 72 1 min。最后延伸 72 7 min ，3 琼脂糖凝胶电泳观察结果并拍照。 3. PCR 产物的分离纯化 按常规的操作制备普通的 1 琼脂糖凝胶，并将 PCR 产物进行电泳，电泳 20分钟后，在紫外灯下观察结果，发现目的 DNA 带已经与溴酚兰和杂带分开，在目的带的前面根据目的带的宽度挖除一小条凝胶，在余下的小槽中倒入熔化的低熔点凝胶，放 4 10 分钟促进其凝固，待低熔点凝胶凝固后，再进行电泳，并观察 DNA带的迁移位置，当目的 DNA 片段迁移至低熔点凝胶内，停止电泳。在长波紫外灯下切下含所需 DNA 片段的低熔点凝胶，移入一个 1.5ml Eppendorf 管中，加入凝胶 5倍体积的 TE 缓冲液，65保温 10 分钟熔化凝胶。冷到室温时加入等体积的 0.1M Tris.Cl 饱和酚，充分混匀，室温下 4000g 离心 10 分钟，回收水相，用等体积酚氯仿、氯仿各抽提一次，将上层水相转移至一个新的 1.5 ml Eppendorf 管中，加入 0.2 倍体积的 10M 乙酸铵和 2 倍体积预冷的无水乙醇，混匀后，放置室温 10分钟，4 12000g 离心 20 分钟沉淀核酸，弃上清，DNA 用 70 乙醇漂洗一次，晾干，溶于适量的超纯水中，20储存备用。 五 重组人 SLC 克隆载体的构建 1.连接 反应体系如下： T4 DNA 连接酶 1ul 10连接 buffer 1ul 纯化的 PCR 产物 4ul pMD18-T 载体 1ul 三蒸水 加至 10ul 离心混匀，4 放置过夜，准备转化。 2. CaCl 2 处理法制备感受态细菌 从低温冰箱中取出冻存的大肠杆菌 DH5，握在手中促进其融化，待菌液部分融化，用无菌接种环沾取少量菌液，划线法接种到 LB 固体培养基上，37培养 6小时，用无菌牙签挑取一个饱满的单菌落接种到 5mlLB 液体培养基中，37摇振培养过夜。取过夜培养物 1ml 接种到 100mlLB 液体培养基中，37摇振培养约 23小时（摇振速度 200300r/min） ，待 OD600 值达到 0.3-0.4 之间时将烧瓶取出立即置冰浴 1015 分钟，分装至 50ml 离心管中，4 4000g 离心 10 分钟，弃上清，倒置滤纸 1 分钟。每管加冰预冷的 0.1M CaCl10ml 重悬菌体，冰浴 30 分钟，4 4000g 离心 10 分钟，弃上清，倒置滤纸 1 分钟。每管再加 4ml 冰预冷的 0.1M CaCl2 轻轻重悬菌体，4放置 24 小时后，将感受态细菌分装成 200 一份，取一份用于转化，其余各管每份各加 10体积的甘油，置70冰箱保存。 3.细菌转化及氨苄抗性克隆的筛选 无菌取新鲜感受态 2002030 分钟。42热休克 90 秒，冰浴 2 分钟。加无抗生素的 LB 液体培养基 800床（100150r/min）混合振荡 45 分钟，1000g 离心 5 分钟，去除部分液体，保留100LA 平板上，37平放 20 分钟，然后倒置培养 14 小时 六 重组克隆的筛选与鉴定 1.PCR 阳性克隆 挑取 LA 平板上的菌落若干个，分别加入到 30 细菌裂解液中，混匀，煮沸 5分钟，冰浴，离心。取上清，反应体系如下。 试剂 用量 细菌裂解液 10PCR buffer 25mM Mg + 4dNTPs Taq DNA 聚合酶 上、下游引物混合物 超纯水 1.02.51.50. 50.250.5补至 251 琼脂糖凝胶电泳观察结果并拍照。 2.重组质粒的分离与纯化（树脂法） 挑选饱满阳性单菌落接种到 5ml 含 Amp 的 LA 液体培养基中过夜培养。取 15ml菌液，4000g 离心 5 分钟，弃上清，扣干，加入 200入 2005 分钟，再加入 20015 分钟，10000g 离心 5 分钟，取上清，加入 800 结合树脂，轻轻混匀，放置 2分钟，10000g 离心 15 秒，弃上清，加 washing buffer1000 洗 2 次，离心弃上清，再加丙酮 500 充分混匀，10000g 离心 15 秒，弃上清，室温干燥 5 分钟，加适量去离子水溶解，65水浴 10 分钟，10000g 离心 5 分钟，收集上清即为提取的质粒。1 琼脂糖电泳鉴定后，20保存备用。 3. 重组克隆的限制性酶谱分析鉴定 反应体系如下： 试剂 体积 质粒 DNA EcoRI BamHI 10buffer C 三蒸水 71129混匀，37水浴 3 小时，1 琼脂糖凝胶电泳观察结果并拍照。 七 DNA 序列分析 以 M-13-Reverse 为测序引物，进行重组质粒的 DNA 序列分析，在 ABI 序列分析仪上由上海博亚生物工程有限公司完成，主要步骤如下： 纯化重组质粒 于 0.5ml 的薄壁 PCR 管中加入以下序列分析反应物 Terminator premix 9.5ul 重组质粒 1.2ug 测序引物 3.2pmol/L 三蒸水 20ul 混匀，加入石蜡油 20ul 15000rpm 离心 10 秒 迅速启动，进行以下循环 96 30 秒；5015 秒；604 分钟，进行 25 循环， 醋酸钠乙醇沉淀后，加入 4ul 上样液，90变性 2 分钟，迅速转移至冰浴， 序列分析胶上样 ABI 序列分析仪进行序列分析 结果与讨论 一 淋巴结组织总 RNA 的提取与纯化 所制备的总 RNA A260/A280 的比值在 1.8 左右，通过琼脂糖变性凝胶电泳检测 RNA 的完整性，可见 28S 和 18S RNA 的比值约为 2:1，表明无 RNA 降解，符合RT-PCR 的反应要求（见图 2） RNA 制备是 RT-PCR 反应的关键步骤，由于 RNA 酶广泛存在，所以 RNA 的制备关键是防止 RNA 酶的污染。我们采取以下措施防范 RNA 酶的污染：（1）配制试剂所用的试剂瓶、量筒、烧杯、吸管等玻璃用品均在 180 度干烤达 5 小时以上。（2）配制试剂所用水均为 DEPC 高压水。 （3）配制试剂及提取 RNA 全