注射用重组人白介素

注射用重组人白介素4 外源 DNA 残留量的检测摘要 目的 检测本实验室生产制备的重组人白介素 4 原液中外源 DNA 的残留量 方法 提取大肠杆菌基因组 DNA，经过酶切变性处理后，加入地高辛标记探针，再用探针进行杂交实验。 结果 包括 DNA 纯度及浓度检测、基因组 DNA 酶切效率的检测、探针标记效率的检测、杂交的免疫检测，显示五个结果均正常。结论 供试品（注射用人重组白介素4 原液）中外源 DNA 的含量小于 0.1ng/L，本批次产品合格。关键词 白细胞介素4 外源 DNA 残留 DIG 探针标记 2Detection of exogenous residues DNA from Injective Recombinant Human IL-4Abstract Objective Detect the exogenous DNA in human recombinant interleukin - 4 concentrate residues which produced by our own lab. Method Extract E. coils genome DNA, deal with the enzyme denaturation, add tags digoxin probe, probe hybridization experiments. Test results including five: DNA purity and concentration, genomic DNA enzyme efficiency of detection, probe detection, the efficiency of hybridization of immune detection, experiment shows five results were normal. Conclusion The test shows that the samples (concentrate) employing recombinant interleukin - 4 injection of exogenous DNA content is less than 0.1 ng/mu L, so this batch product is qualified.Keyword Interleukin-4 the exogenous residues DNA DIG labeled probe 3前言基因工程药物中宿主细胞残余 DNA 对人体可能造成插入突变，导致抑癌基因失活，癌基因被激活等严重危害，外源大肠埃希氏菌 DNA 进入人体后, 可能导致肿瘤的发生 1， 因而对基因工程药物中外源 DNA 的控制具有重要意义。注射用重组人白介素4 中外源 DNA 经变性为单链后，吸附于固相尼龙膜上，在一定温度下可与相匹配的单链 DNA 复性而重新结合成双链 DNA，称为杂交 2，应用 DNA 杂交技术，将特异性单链 DNA 经地高辛（DIG）探针标记后，与吸附在尼龙膜上的注射用重组人白介素4 单链 DNA 杂交，加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体与地高辛标记的探针相结合，再加入碱性磷酸酶的作用底物 CSPD，通过相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性 DNA 对照比对后，可测注射用重组人白介素4 中外源 DNA 残留量 4。目前，基因工程药物在攻克肿瘤、心血管系统等一些疑难病症等领域，发挥着巨大的作用 8。本实验室生产的注射用重组人白介素4，采用大肠杆菌作为工程菌，提取 pET32a( + )载体与 pUC18/ mIL24 质粒 ,用限制性内切酶NdeI 酶切得到带有互补粘性末端的载体和目的基因片段 ,用 T4 DNA 连接酶连接后转入 JM109 中 ,涂布在加有氨卞青霉素的固体 LB 培养基上 ,培养过夜 11。挑取阳性菌落，经质粒酶切验证、DNA 测序，确认质粒构建正确且无突变后 ,转入大肠杆菌 BL21 感受态细胞 ,从而获得 pET32/ rmIL24 质粒的 BL21(DE3)表达工程菌。控制相关条件促使人的白介素-4 基因（目的基因）表达，生产重组蛋白药物人白介素4（约 15KD） 。经目的基因工程菌的发酵，收集菌体沉淀，超声破菌后离心，3M 盐酸胍洗涤， 7M 盐酸胍溶解，制得包涵体，逐步降低变性剂浓度复性后，再经脱盐、分子筛层析、离子交换层析等系列纯化后 3，得到产品原液。重组的蛋白产品功能一般与天然相似，但由于生产方法不同，其纯度要求、毒副作用和体内药物代谢动力学性质仍与天然的产品有很大区别 9，所以对原液进行相关检测是必要的，外源 DNA 的含量超标，核酸残留量控制不好，可使药物产生毒副作用 7，本实验借鉴 southern blot 的技术手段，应用 DNA 与 DNA 杂交的原理，检测产品原液中外源 DNA 的残留量，以达到质量监控的目的。4材料与方法1.实验材料1.1 样品来源 本实验室生产制备的重组人白介素-4 原液。1.2 实验设备1.2.1 实验器材名称 厂家 型号软片冲洗机 虎丘影像科技（苏州）有限公司 HQ320XT移液器 1000L eppendorf 1001000 L移液器 100L eppendorf 10100 L移液器 10L eppendorf 0100 L移液器 2.5L eppendorf 02.5 L1.2.2 实验材料名称 厂家 型号细菌基因组 DNA 提取试剂盒 TIANGEN Biotech H7208DNA 酶切 BsuRI(Hae) fermentas ER0151杂交试剂盒（Detection Starter Kit） Roche 11585614910马来酸 成都科龙试剂厂 500g氯化钠 天津海龙药业有限公司 1000g氨基丁三醇 重庆青阳药业有限公司 500g柠檬酸钠 成都科龙试剂厂 500gSDS(十二烷基硫酸钠) 湖南尔康制药有限公司 500g5甲醇 成都科龙试剂厂 500mL冰醋酸 成都科龙试剂厂 500mL1.3 溶液配制1TAE：量取 8mL 50TAE（称取 Tris 242g，Na 2EDTA.2H2O 37.2g 于 1L 烧杯中，加入 800ml 无菌水（电阻率18.2M.cm） ，充分搅拌溶解。加入57.1ml 冰醋酸，充分混匀，继续加入无菌水定容至 1L。 ）加至 382mL无菌水中，混匀，室温保存。washing buffer（1L）：称取马来酸（顺丁烯二酸）11.6g，氯化钠 8.775g, 适量无菌水（电阻率18.2M.cm）溶解，调 pH 至 7.5，定容至 1L 后，加入 3ml 0.3% 吐温 20，充分混匀。maleic acid buffer（1L ）：称取马来酸（顺丁烯二酸）11.6g，氯化钠 8.775g,加入适量无菌水（电阻率18.2M.cm）溶解，调 pH 至 7.5，定容至1L。blocking buffer（1 ）：用 Maleic acid buffer 稀释试剂盒中的 blocking buffer 10（瓶号 ）至 1，即取 2mL 10 blocking buffer 加入 18mL Maleic acid buffer,现配现用。抗体溶液：试剂盒中的抗体（瓶号）溶液经 10000r/min，5min 离心，取上层液体用 1blocking buffer 1：10000 稀释（1L 抗体溶液 + 10mL 1blocking buffer） 。detection buffer：称取 Tris 碱 12.1g，NaCl 5.85g，适量无菌水（电阻率18.2M.cm）溶解，调 PH 至 9.5，定容至 1L。1%蛋白酶 K 溶液：称取蛋白酶 K 0.1g,溶于 10mL 无菌水（电阻率18.2M.cm）中,分装储存20。0.3%牛血清白蛋白溶液：称取 BSA 0.3g,溶于 1mL 无菌水（电阻率18.2M.cm）中,分装储存20。蛋白酶缓冲液（pH8.0）：量取 1M Tris 溶液（PH8.0）1mL、5M NaCl 溶液2mL、0.5M 乙二胺四乙酸二钠溶液（PH 8.0）2.0mL、20%SDS 溶液（PH 8.0）2.5mL，加无菌水（电阻率18.2M.cm）至 10mL。6TE 缓冲液（pH8.0 ）：量取 1M Tris 溶液（PH8.0）10mL、0.5M 乙二胺四乙酸二钠溶液（PH8.0）2.0mL，加 UP 水（电阻率18.2M.cm ）至1000mL。1%鱼精 DNA 溶液：精密称取鱼精 DNA 0.1g 于 10mL 量瓶中，用 TE 缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，用 7 号针头反复抽打以剪切 DNA 成为小分子，分装后贮藏于20。DNA 稀释液：取 1%鱼精 DNA 溶液 50L，加 TE 缓冲液至 10mL。20SSC（1L）：称取氯化钠 175.32g，柠檬酸钠 88.23g，加无菌水（电阻率18.2M.cm）1L 溶解。1%SDS（1L ）：称取 10g 十二烷基硫酸钠溶于 1L 无菌水（电阻率18.2M.cm）中。2SSC 0.1%SDS（1L）：取 100mL1%SDS，100mL20SSC，加无菌水（电阻率18.2M.cm）800mL，混匀。1SSC 0.1%SDS（1L）：取 100mL1%SDS，50mL20SSC，加无菌水（电阻率18.2M.cm）850mL，混匀。2.实验方法2.1 培菌(PET32a-NdeI-hil4 ，于 2007 年 5 月保种)2.1.1 配制 LB 培养基：称取蛋白胨 2g、酵母浸出物 1g、氯化钠 2g 于 200mL 蓝口玻璃瓶中，加入无菌水（电阻率18.2M.cm）200mL。2.1.2 121，20min 高压蒸汽灭菌 LB 培养基。2.1.3 待培养基冷却，超净工作台内加入氨苄西林钠 100L（浓度为 0.2g/ml） ，接种 PET32a-NdeI-hil4 菌液 20L，37，220r/min 摇床培养，过夜。2.2 提取细菌基因组 DNA(细菌基因组 DNA 提取试剂盒)2.2.1 分别取细菌培养液 15mL 于标记 A、B 的离心管中（细菌提取量约为1.0108 个细胞） ，10000rpm, 离心 1 分钟,尽量吸尽上清。2.2.2 向菌体沉淀中加入 200L 缓冲液 GA，振荡至菌体彻底悬浮，加入 4L RNaseA(100mg/mL)溶液，目录号：RT405-11，振荡 15s，室温放置5min.72.2.3 向管中加入 20L 蛋白酶 K 溶液，混匀。2.2.4 加入 220L 缓冲液 GB，振荡 15s，70放置 10min,简短离心去除管内壁水珠。 （注：加入缓冲液 GB 时可能产生白色沉淀，一般 70放置 10min会消失，不影响后续实验，如果溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可导致提取 DNA 量少和提取的 DNA 不纯。 ）2.2.5 加入 220L 无水乙醇，充分振荡混匀 15s，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以除去管内壁的水珠。2.2.6 将上步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱 CB3 中（吸附柱 CB3 放入收集管中） ，12000rpm，30s 离心，倒废液，将吸附柱 CB3 放入收集管中。2.2.7 吸附柱 CB3 中加入 500L 缓冲液 GD（使用前应加入 17mL 无水乙醇） ，12000rpm，30s 离心，倒废液，吸附柱 CB3 放入收集管中。2.2.8 吸附柱 CB3 中加入 700L 漂洗液 PW（使用前应加入 50mL 无水乙醇） ，12000rpm，30s 离心，倒废液，吸附柱 CB3 放入收集管中。2.2.9 吸附柱 CB3 中加入 500L 漂洗液 PW，12000rpm ，30s 离心，倒废液，吸附柱 CB3 放入收集管中。2.2.10 将吸附柱 CB3 放回收集管中，12000rpm，离心 2min，倒掉废液，吸附柱 CB3 室温放置 30min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 （漂洗液中的乙醇残留，会影响后续的酶反应试验。 ）2.2.11 将吸附柱 CB3 转入一个干净的离心管，向吸附膜中间部位悬空滴加50L 洗脱缓冲液 TE，室温放置 5min，12000rpm，离心 2min，溶液收集入离心管中。 （注：为增加基因组 DNA 的得率，可将离心得到的溶液加入到吸附柱 CB3，室温放置 2min，12000rpm,2min 离心，洗脱缓冲液不得少于 50L，加入体积小会影响回收效率。若用水做洗脱液，应用氢氧化钠溶液调至 PH7.08.5，PH 低于 7.0 会降低效率。 ）2.2.12 DNA 溶液保存于20。2.3 DNA 溶液浓度、纯度检测2.3.1 1%琼脂糖凝胶检测 DNA 溶液的纯度82.3.1.1 制胶：称取 0.6g 琼脂糖于 100mL 三角瓶中，加入 60mL 1TAE，微波炉反复打热至琼脂糖完全融化，取出，稍冷加入两滴 goldView，凝胶倒入插有梳子的电泳板，待凝备用。2.3.1.2 上样：拔除样品梳，取出凝胶置入电泳槽中，点样孔放负极，加入适宜体积 1TAE（没过琼脂糖凝胶为准） ，电泳孔中用加样枪依次点入8L Maker(DNA ladder mix)；DNA 溶液 5L+DNA loading buffer 2L（事先混匀，再用加样枪吸取点入电泳槽） 。2.3.1.3 电泳：接通电源，120V 电泳 45 分钟。2.3.2 浓度测定2.3.2.1 稀释 DNA 溶液：取 10L DNA 溶液加入 290L TE 缓冲液中（稀释 30倍） 。2.3.2.2 用 TE 缓冲液调零，分别于 260nm、280nm 处测 OD 值，稀释 30 倍后的DNA 浓度为 6.1669g/mL，所以经基因组试剂盒提取的 DNA 浓度为6.166930=185.007g/mL2.4 基因组 DNA 酶切2.4.1 离心管中按体积加入以下物质（构建 20L 酶切体系）10BufferR 2LDNA（1.52.0g） 10.8LBsuRI(Hae) 2L无菌水（电阻率18.2M.cm） 5.2L2.4.2 离心管封口膜封口，37水浴 3 小时。2.4.3 1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效率。2.4.3.1 制胶：称取 0.6g 琼脂糖于 100mL 三角瓶中，加入 60mL 1TAE，微波炉反复打热至琼脂糖完全融化，取出，稍冷加入两滴 goldView，凝胶倒入插有梳子的电泳板，待凝备用。2.4.3.2 上样：拔除样品梳，取出凝胶置入电泳槽中，点样孔放负极，加入适宜体积 1TAE（没过琼脂糖凝胶为准） ，电泳孔中用加样枪依次点入8L Maker(DNA ladder mix)；DNA 酶切后混合溶液 5L+DNA loading 9buffer 2L（事先混匀，再用加样枪吸取点入电泳槽） 。2.4.3.3 电泳：接通电源，120V 电泳 45 分钟。2.5 DIG 探针标记2.5.1 取 10L 模板 DNA 溶液（浓度经酶切后为 2g/L）于 0.5mL 离心管中，另加入 6L 无菌水（电阻率18.2M.cm ） ，使终体积为 16L。2.5.2 水浴锅中沸水煮 10min，立即冰上冷激（变性） 。2.5.3 加入标记混合物 DIG-High Prime（瓶号） 4L，混匀，简短离心将反应液收集于管底。2.5.4 封口膜封口后，37水浴 15 小时。2.5.5 向 EP 管中加入 2L 0.2M EDTA（PH8.0 ） ，终止反应。2.6 探针标记效率的检测2.6.1 剪刀剪取尼龙膜，长 12cm，宽 3cm，切角标记区分点样面，甲醇中浸泡45s，取出，washing buffer 中漂洗 45s，室温晾干。2.6.2 稀释标记物表 1 DNA 标记物与标准品的倍比稀释DNA 标记物（浓度为55ng/L）DIG-labelled DNA(标准品 初浓度为 5ng/L)取 1L 待稀释物+4.5LDNA 稀释液 10ng/L取 1L（10ng/L）+ 9LDNA 稀释液 1ng/L取 1L 标准品+4L 纯水1ng/L取样 1L（1ng/L）+ 9LDNA 稀释液 100pg/L 100pg/L取样 1L（100pg/L）+9LDNA 稀释液 10pg/L 10pg/L取样 1L（10pg/L）+2.3LDNA 稀释液 3pg/L 3pg/L取样 1L（10pg/L）+ 9LDNA 稀释液 1pg/L 1pg/L取样 1L（3pg/L）+ 9LDNA 稀释液 0.3pg/L 0.3pg/L待 稀释 物稀释后浓度稀释方法102.6.3 点样：尼龙膜上排间隔 1cm 依次点样（DNA 标记物）：1ng/L、100pg/L、10pg/L、3pg/L、1pg/L、0.3pg/L 、0.1pg/L、0.03pg/L、0.01pg/L、空白对照（TE 缓冲液） ，上样量 2L；尼龙膜下排间隔 1cm 依次点样（DIG-labelled DNA 标准品） ，浓度与上排标记物相对应，上样量 2L，室温晾干后，80烤箱烘烤 20 分钟。2.6.4 紫外交联仪固定 DNA 探针，正反面各 2.5 分钟。2.6.5 尼龙膜浸入 20mL Maleic acid buffer 平皿中，室温摇动漂洗 5 分钟。2.6.6 尼龙膜在 10mL blocking buffer 中室温封闭 30 分钟。2.6.7 镊子夹取尼龙膜置入杂交袋中，在点样面加入 5mL 抗体溶液，37，孵育 30 分钟。2.6.8 取出尼龙膜，washing buffer 中漂洗 2 次，15min/次2.6.9 detection buffer 浸泡平衡 5min2.6.10 镊子夹取尼龙膜置入杂交袋中，在点样面加入 CSPD 500L，37，避光孵育 10min2.6.11 暗室曝光，洗片。2.7 杂交2.7.1 剪刀剪取长 8cm、宽 3cm 尼龙膜，甲醇中处理 5s，washing buffer 中漂洗5s，室温晾干后，80烤箱烘烤 30 分钟。2.7.2 蛋白酶 K 处理样品（原因：基因工程产品中微量残余 DNA 的检测受蛋白质的干扰较大, 由于其含量远高于残余 DNA, 检测结果可能导致假阳性 （6） ） ，处理方法如下表所示：表 2 蛋白酶 K 处理样品处理样品 加样量 1%蛋白 蛋白酶缓 0.3%B ddH2O 总体积取样 1L（1pg/L）+ 9LDNA 稀释液 0.1pg/L 0.1pg/L取样 1L（0.3pg/L）+ 9LDNA 稀释液 0.03pg/L 0.03pg/L取样 1L（0.1pg/L）+ 9LDNA 稀释液 0.01pg/L 0.01pg/L11（L） 酶K（ L）冲液（L）SA（L）（L） （L）供试品（IL-4 浓度为 100g/mL）100 2 20 0 78 200标记物 D1（外源DNA 浓度为10ng/L）100 2 20 3.3 74.7 200标记物 D2（外源DNA 浓度为1ng/L）100 2 20 3.3 74.7 200标记物 D3（外源DNA 浓度0.1ng/L）100 2 20 3.3 74.7 200阴性对照（DNA 稀释液）100 2 20 3.3 74.7 200空白对照（ TE 缓冲液）100 2 20 3.3 74.7 2002.7.3 将以上 16 号离心管封口膜封口，37水浴箱中孵育 4h，取出 100煮10min，冰上冷却后，简短离心。2.7.4 点样：在烤干后的尼龙膜上按 D1、D2、D3、阴性对照、供试品、空白对照的顺序间隔 1cm 上样 2L，室温晾干，80烤箱烘烤 30 分钟。2.7.5 紫外交联：尼龙膜正反面各 2.5 分钟，紫外强度为 250Mw/cm2。2.7.6 预杂交：镊子夹取尼龙膜置于杂交袋中，点样面加入 5mL 预杂交液（DIG Easy Hyb granules 瓶号） ，65预杂交 2 小时。2.7.7 杂交：弃去杂交袋中的预杂交液，加入探针混合液（离心管中加入 8L探针和 32L TE 缓冲液，封口膜封口，100煮 5min，冰上冷却，简短离心，加样枪吸取 40L 混合液于 8mL 预杂交液中，混匀） ，65杂交过夜。122.8 免疫检测2.8.1 杂交后洗膜：2SSC 0.1%SDS 溶液室温洗膜 2 次，5min/次，1SSC 0.1%SDS 65 洗膜 2 次， 15min/次。2.8.2 washing buffer 室温洗膜 5 分钟。2.8.3 blocking buffer 室温封闭 60 分钟。2.8.4 镊子夹取尼龙膜置入杂交袋中，在点样面加入抗体溶液 5mL，37，孵育60 分钟。2.8.5 washing buffer 室温洗膜 3 次，10min/次。2.8.6 20mL detection buffer 浸泡平衡 5 分钟。2.8.7 镊子夹取尼龙膜置入杂交袋中,在 DNA 面加入 200mL CSPD 显影液，37，避光孵育 10 分钟。2.8.8 暗室曝光，洗片。结果结果 1：图 1：1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 溶液的纯度1%琼脂糖凝胶电泳检测经细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取的 DNA 溶液的纯度，电泳 45 分钟之后，电泳图只有一条带，无拖尾现象，说明经提取的大13肠埃希氏菌基因组 DNA 纯度合格。结果 2：表 3 DNA 溶液浓度测定结果参数 数值A260 0.2420A280 0.1308A260/ A280 1.8500浓度（g/mL） 6.1669经细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取的 DNA 溶液的浓度测定，用 TE 缓冲液调零，DNA 应该在 OD260 处有显著吸收峰，A 260 应该在 0.21.0 之间，A260/A280 处在 1.82.0 之间，根据以上标准，可知此次测定有效，原 DNA 溶液的浓度为 185.007g/mL结果 3：图 2：1% 琼脂糖凝胶电泳检测酶切效率基因组 DNA 很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化 DNA，为了获得理想的结果，模板 DNA 应该线性化，且大小应该在 100bp 以上。如果模板 DNA 大于 5kb，那么在标记之前应该采用14限制性酶切序列为 4 个核苷酸的限制性酶（如 Hae ）对模板进行酶解。由图可知，酶切后的片段大小满足要求，酶切效率合格。结果 4：图 3：DIG 探针标记效率检测上排为九个浓度梯度的 DNA 标记物和 TE 缓冲液，DNA 标记物的浓度分别为1ng/L、100pg/L、10pg/L、3pg/L、1pg/L 、0.3pg/L、0.1pg/L、0.03pg/L、0.01pg/L，下排为相应浓度的标准品 DIG 标记的对照 DNA 20L，5g/mL 质粒 pBR328 DNA（Bam HI 线性化）澄清溶液，用于确定标记效率 ，由上图可知，下排标准品曝出的光点随着浓度降低而变小，检测的灵敏度高达 0.01pg/L，上排结果显示，我们的标记物灵敏度也高达 0.01pg/L，可以作为外源残留 DNA 含量的检测的依据。结果 5：图 4：杂交后免疫检测阳性对照 D1、D2、D3 三个点随 DNA 标记物浓度降低光点变弱，阴性对照、空白对照均无光点曝出，说明此次检测有效，供试品（注射用人重组白介素4 原液）中外源 DNA 的含量低于 0.1ng/L，符合中华人民共和国药典的规定，此批次产品中外源 DNA 含量未超标，合格。15讨论1、 如果实验结果出现低灵敏度，存在原因可能为：无效的探针标记，一定要通过与标记的对照 DNA 进行比较，检查地高辛所标记探针的标记效率。膜的类型错误，用于点杂交和 southern 杂交的膜的质量影响着检测的灵敏度和速度。建议采用 Roche Molecular Biochemicals 公司生产的带正电荷的尼龙膜。某些膜可能引起强背景，硝酸纤维素膜不能够用于此操作 5。无效的杂交，应提高杂交缓冲液中地高辛标记 DNA 探针的浓度。抗体浓度低，适当提高 anti-DIG-AP 结合物的浓度。曝光前的前孵育，可以增加向 X 光片曝光前的前孵育时间，持续时间大于 30 分钟，最长可延长至 12 小时。曝光时间短，应当适当增加向 X 光片曝光的时间，另外胶片的类型也可能影响灵敏度。2、 如果实验结果出现高背景，可能存在以下原因：无效的标记，标记前一定要检测 DNA 的纯度，倘若纯度不够，应采用苯酚/氯仿的方法或者乙醇沉淀的方法纯化 DNA。膜的类型错误，此操作方法非常适用于正电荷尼龙膜的应用，但是一些膜由于带有较高的正电荷可能产生背景，某些膜的批间差异也可能产生此问题。标记探针的浓度过高，因此降低地高辛标记 DNA 的浓度是必须的，可以对未点样的膜进行杂交并不断提高探针浓度，来确定加入探针浓度的限度，整个操作过程中不能让膜干燥。抗体浓度过高，降低 anti-DIG-AP 结合物的浓度，同时增加洗涤液，封阻液的体积，延长洗涤和封闭步骤的时间，有斑点出现的背景可能是由 anti-DIG-AP 中的沉淀引起的：可以通过短暂离心的方法除去。曝光前孵育时间太长，针对此种情形，应当适当缩短前孵育时间。3、 goldview 是一种可替代 EB（溴化乙锭）的新型核酸染料，与核酸结合后能产生很强的荧光信号，紫外透射光下双链 DNA 呈绿色荧光，无致癌作用。4、 本次检测中尼龙膜的处理比较重要，甲醇处理后,点样后应该 80烤箱足够烤干，否则曝出的黑点为空心环，达不到检测的目的,此步为多次试验总结出的经验操作。165、 在 15-25条件下，采用图像仪曝光大约 5-20 分钟，或者用 X 光片曝光1 分钟。 化学发光持续至少 48 小时，在检测反应开始后的几个小时里信号是不断增强的，将达到一个阈值，这时的信号强度几乎可以持续到接下来的 24-48 小时，曝光都可以在此理想的信号强度下完成。7、 夹取尼龙膜的镊子应该事先裹上封口膜，防止尼龙膜被刮花，尼龙置入杂交袋中，加入预杂交液、杂交液、抗体溶液、显影液 CSPD 之后，必须赶尽杂交袋内的气泡、严实封口，否则会严重影响实验结果，可能出现爆出的光点或者背景中出现多余的光圈，影响实验的最终判断。8、 模板 DNA 的纯度、大小、数量对结果都有影响，模板 DNA 应该保证纯度，不含蛋白质和 RNA,进行探针标记的模板 DNA 大