微生物学课件22

第三节 细菌形态与结构检查法【 教学内容教学内容 】 细菌的 显微镜放大法和 染色检查法法。【 教学要求 】 掌握： 细菌的 染色检查法 。了解： 细菌的 显微镜放大法 。【 教学重难点 】 重点： 细菌的 染色检查法 。 难点： 细菌的 染色检查法 。 【 教学时数 】 ： 2学时【 教学方法 】 ：讲授法为主，演示法为辅。 显微镜放大法 细菌形体微小，肉眼不能直接看到，必须借助显微镜（普通光学显微镜、电子显微镜）放大后才能观察。 染色检查法 细菌体小 ,半透明，经染色后才能观察较清楚。普通光学显微镜的分辨率为 0.25um。 一般细菌都大于0.25um， 故可用普通光学显微镜观察。、普通光学显微镜 (light microscope)一、显微镜放大法电子显微镜的分辨率为 1nm。 不仅能看清细菌的外形，内部超微结构可一览无余。、电子显微镜 (electron microscope)肺炎链球菌荚膜荚膜一、显微镜放大法3、透射电镜4、扫描电镜二、染色检查法由于细菌细胞微小又透明，一般先要经过染色才能作显微观察革兰氏染色法细菌染色鉴别染色法简单染色法负染色：正染色死菌活菌抗酸性染色法芽孢染色法姬姆萨染色法荚膜染色法用美蓝或 TTC等作活菌染色（一）单染色法 1、原理 细菌的体积小，五色半透明，在普通光学显微镜下不易观察清楚，通常需染色来增加菌体与背景之间的色差，这比不染色标本清楚易辨。 由于细菌的等电点为 pH2 5，在接近中性的环境中通常带负电荷，易与带正电荷的碱性染料相结合而染上颜色，故常用亚甲蓝、碱性复红、草酸铵结晶紫等染料染色。单染法只使用一种染料，所染的细菌均被染成一种颜色，一般能够显示细菌的形态、排列和大小，但不能显示细菌的内部构造。 、常用染料和器具 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 18 24h培养物，生理盐水，亚甲蓝染色液，碱性复红染液，香柏油，二甲苯，显微镜，接种环，吸水纸，载玻片，酒精灯，擦镜纸。、方法 （ 1）涂片 取洁净的载玻片一块，滴一小滴生理盐水于载玻片中央 (如被检材料是液体，可不加生理盐水)。将接种环在酒精灯火焰上灭菌，冷却后，伸人被检菌试管取菌少许 (切不可多，更不可将培养基刮下 )，混入载玻片上的生理盐水中，磨匀并涂抹成直径 1 5cm左右的均匀薄层菌膜。将接种环灭菌后放回原处。 （ 2）干燥 涂片最好在室温中让其自然干燥。有时为了干燥得快些也可在酒精灯火焰上方烘干，但勿紧靠火焰；也可以用吹风机吹干。 、方法 （ 3）固定 让菌膜面朝上，将载玻片在酒精灯火焰外层来回通过 3次，此为 “固定 ”。目的是使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使细菌粘附于玻片上，染色和水冲时不会脱落。 （ 4）染色 将细菌涂片平置，滴加 1滴亚甲蓝 (或复红染液 )于菌膜上，染液以覆盖涂抹的标本为度，染色 12min 。 （ 5）水洗 斜置载玻片，用细水流从上端流下洗去多余的染液。 （ 6）干燥 自然干燥或用吹风机吹干水分。 （ 7）镜检 先用低倍镜找到物像，并将物像调到视野中央，再于标本上滴上一滴香柏油，置于油镜下进行观察。 、注意事项 （ 1）固定时温度不可过高，以载玻片反面触及皮肤时热而不烫为宜。 （ 2）水洗时，不要对着标本直接冲洗，以免冲去被检标本，一般以冲洗下来的水基本无色为度。 （ 3）染色完毕，倾去水分，于室温中自然干燥，不可在标本上擦试，以免擦损标本。 （二）革兰染色法： C.Gram（革兰）于 1884 年发明的一种鉴别不同类 型细菌的染色方法。二、染色检查法（二）革兰染色法、染色步骤（ 1）初染（结晶紫 30S）（ 2） 媒染剂（碘液 30S）（ 3） 脱色（ 95%乙醇 1020S）（ 4） 复染（蕃红 30 60S）ABBBABAA（ 1）初染（结晶紫 30S）革兰氏染色程序和结果 （ 1）初染（结晶紫 30S）（ 2） 媒染剂（碘液 30S） （ 3） 脱色（ 95%乙醇 1020S）（ 4） 复染（蕃红 30 60S）ABBBABAA革兰氏染色程序和结果（ 2）媒染剂（碘液 30S） （ 1）初染（结晶紫 30S）（ 2） 媒染剂（碘液 30S） （ 3） 脱色（ 95%乙醇 1020S）（ 4） 复染（蕃红 30 60S）ABBBABAA革兰氏染色程序和结果（ 3）脱色（ 95%乙醇 1020S）（ 1）初染（结晶紫 30S）（ 2） 媒染剂（碘液 30S） （ 3） 脱色（ 95%乙醇 10-20S）（ 4） 复染（蕃红 30 60S）ABBBABAA革兰氏染色程序和结果（ 4）复染（蕃红 30 60S）A： 革兰氏阳性细菌 G+B： 革兰氏阴性细菌 G为什么？（ 1）初染（结晶紫 30S）（ 2） 媒染剂（碘液 30S） （ 3） 脱色（ 95%乙醇 1020S）（ 4） 复染（蕃红 30 60S）、染色原理 第一步： 结晶紫使菌体着上紫色 第二步： 碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。 第三步： 酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。 G+ 菌： 细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫 -碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。 G菌： 肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高 ,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫 -碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后呈红色。、结果判断 菌体呈紫色的为革兰氏阳性菌（ G+） 菌体呈红色的为革兰氏阴性菌（ G-）阳性菌阴性菌革兰阳性 革兰阴性、注意事项 （ 1）载玻片要洁净无油。 （ 2）涂片以匀薄为佳，切不可浓厚。过于密集的菌体，因洗脱不匀常呈假阳性。 （ 3）要严格控制各试剂的作用时间，尤其是酒精脱色，时间过短，革兰阴性菌可染成紫色造成假阳性；反之，脱色时间过长，革兰阳性菌也可被染成红色造成假阴性。 （ 4）碘液配制后，应装在密闭的暗色瓶内储存。如因储存不当，试液由原来的红棕色 变成淡黄色，则不宜再用。本次课作业 细菌染