质粒提取及酶切鉴定

实验一 质粒提取及酶切鉴定P158 基因工程 （ genetic engineering）是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的 DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。相关基础知识 目的基因 工具酶 载体基因工程相关物质质粒u 存在于细菌细胞内、染色体外、共价闭合的存在于细菌细胞内、染色体外、共价闭合的 小型小型 环状环状 DNA分子分子 (covalent closed circular DNA)。u具有具有 自我复制自我复制 功能。功能。u带有抗性基因及表型识别等带有抗性基因及表型识别等 遗传性标记物遗传性标记物u经改造后具有经改造后具有 多克隆位点多克隆位点 。质粒 (plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息 , 会赋予宿主细胞一些遗传性状限制性核酸内切酶：-基因工程的手术刀是分子生物学研究中的一种工具酶，能识别 DNA的特异序列 , 并在识别位点或其周围切割双链 DNA的一类内切酶。如： EcoR 和 Hind 的识别序列和切口是：EcoR ： GAATTCHind ： AAGCTT概念与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统（ restriction-modification system）， 限制外源DNA， 保护自身 DNA。作用分类酶 结 构 、作用、 识别 及切割特 异 性的不同分 为 、 、 ，基因工程技 术 中常用 型 型酶具有限制和 DNA修 饰 作用，且 识别 及切割位点不同（下游 100-1000bp） 型酶具有限制和 DNA修 饰 作用， 识别 及切割位点不同（相距 较 近）（ 1）识别及切割位点相同（ 2）识别序列通常为 4 8bp的回文结构；（ 3）切割可产生两类切口，三种末端。 型限制酶特点 型酶识别序列特点 回文结构(palindrome) 切口 ： 平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBam HGTCCAG GCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口 粘端切口钝性末端 粘性末端掌握质粒 DNA提取的原理与方法 了解 DNA限制性核酸内切酶酶切鉴定原理 质粒提取原理质粒的提取 主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异： 在碱性环境中，线性的大分子细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒 DNA仍为自然状态； 溶菌酶 可破坏菌体细胞壁， 十二烷基硫酸钠（ Sodium dodecyl sulfate, SDS）可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂（ SDS）处理后，细菌 DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒 DNA则留在上清液中。再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒 DNA。 由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。Relaxed circleLinearized formSuper-coiled form 与 DNA分子量标准物（ Marker）比较能大概判断未知 DNA的分子量 质粒 DNA为环状，在酶切彻底的情况下， DNA片段数与酶切位点数目相同质粒 DNA酶切鉴定的原理Marker 质粒 DNA过夜酶切操作步骤 (Methods) 分组： 4人 /组，每组提取两种质粒（空载及重组质粒） 1.质粒的提取 （ 1） 接种一个单菌落（ single colony）于 5 mL含相应抗生素的 LB培养基中，37 振荡培养至饱和状态（ A600=0.4）或过夜。 （教师准备） （ 2） 取 1.5 mL离心管一支，加入 1.4 mL菌液， 13 000 r/min离心 1 min去掉上清液。加入150 L 的溶液 ，充分混悬细菌，在室温下放置 10 min。 （ 3） 加入 200 L 新配制的溶液 。加盖，颠倒 5次使之混匀。冰上放置 5 min。 （ 4） 加 150 L 预冷的溶液 ，加盖后颠倒 5次混匀，冰上放置 15 min。 13 000 r/min离心 5 min， 取 400 L 上清液移入另一离心管中。 （ 5） 向上清液中加入等体积苯酚 /氯仿，震荡混匀， 13 000 r/min离心 2 min， 300 L 上清液转移至新的离心管中。 （ 6） 向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室温放置 2 min。离心 5 min，倒去上清乙醇溶液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 （ 7） 加入 1 mL 70 %乙醇，震荡并离心， 13 000 r/min离心 2 min，倒去上清液，晾干，加入 20 L的 TE缓