食品的卫生细菌学检验医学

第一节食品中菌落总数的测定 一、 菌落总数 是指食品 检样经过处 理，在一定 条 件下培养后 ,所得 1mL(g)或 1cm2面积 检样中所含菌落的总数。 二、菌落总数测定的意义 1、判定食品被 细 菌 污 染的程度及 卫 生 质 量 。 2、 预测 食品存用的期限 长 短。 3、了解 细 菌在食品中的繁殖 动态 。 四、平板倾注法测定菌落总数 检验步骤 (程序 )： 检样 稀释处理 做平板 培养 菌落 计数 报告结果 （一）、样品稀释及做平板 1ml 1ml1ml 1ml 1:10 1:10001:100 1:10000 1ml1ml 1ml 加入 46 营养琼脂 1215ml 25g/m l样品 生理盐 水 检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所 用时间不宜超过 20min，以防止细菌有 所死亡或繁殖。 （二）培养 普通食品 :37 48h 倒放平板 清凉饮料、调味品、糕点、酒类： 37 24h 水产品 : 30 48h （三）计数和报告 到达 规 定培养 时间 ， 应 立即 计 数。如果不能立即计数，应将平板 放置于 0 4 ，但不得超过 24h。 1、菌落的选择 （ 1）、单个菌做一个菌落计 （ 2）、呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作 为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每 条链均应按一个菌落计算。 （ 3）、如片状菌落不 到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平 板的菌落数乘 2代表全平板的菌落数。 2、平板菌落计数的选择 （ 1）、 选 取菌落数在 30 300之间的平板（ SN标准要求为 25 250个菌落） ， 若有二个 稀释度均在 30 300之间时，比值小于或等 于 2取平均数，比值大于 2则其较小数字。 （ 2）、如均大于 300，则取最高稀释度的平 均菌落数乘以稀释倍数报告 （ 3）、如均小于 30，则以最低稀释度的平均 菌落数乘稀释倍数报告 （ 4）、如菌落数有的大于 300，有的又小于 30，不在 30 300之间，以最接近 300或 30的 平均菌落数乘以稀释倍数报告 （ 5）、如所有稀释度均无菌落生长，则应按 小于 1乘以最低稀释倍数报告。 3、 菌落数的报告 菌落数在 1 100时，按实有数字报告， 1) 如大于 100时，则报告前面两位有效数字，第三 位数按四舍五入计算。 2) 固体检样以克（ g)为单位报告， 3) 液体检样以毫升（ ml）为单位报告， 4) 表面涂擦则以平方厘米（ cm2）报告。 (四 )、检验注意事项 1、对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板； 2、吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口 、管口的外围部分； 3、吸管插入试样液内的深度不得小于 2.5cm,调整 时要使管尖与容器内壁紧贴 ; 4、进行稀释时 ,吸管口不得与稀释液接触 ; 5、检样从开始稀释到倾注最后一个平 皿所用时间不宜超过 20min. 6、稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍 数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象， 不可作为检样计数报告的依据。 第二节 食品中大肠菌群的检验 一、大肠菌群 1、 什么是大肠菌群？ 指一群需氧及兼性厌氧，在 37 能分解乳糖产酸 、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。 2、大 肠 菌群的 组 成 : 大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏 菌属和阴沟肠杆菌。 属 代表种 致病性 埃希氏菌属 （ Escherichia ） 大 肠 埃希氏菌 (E.coli) 肠 道外感染， 急性腹泻 志 贺 氏菌属 （ Shigella） 痢疾志 贺 氏菌 (Sh.dysenteriae) 细 菌性痢疾 爱 德 华 氏菌属 （ Edwardsiella） 迟纯爱 德 华 氏菌 (E.tarda) 蛇 类 等血 动 物的正常 肠 道寄居菌，偶 见 于健康 人或腹泻者 粪 便内 沙 门 氏菌属 （ Salmonella ） 伤 寒沙 门 氏菌 (S.typhi) 肠热 症、急性 肠 炎、 败 血症 枸 橼 酸杆菌属 (Citrobacter) 弗 劳 地氏枸 橼 酸杆菌 (C.freundii) 条件致病菌，引起 继发 性感染 克雷伯氏菌属 (Klebsiella) 肺炎克雷伯氏菌 (K.pneumoniae) 肺炎，泌尿系、 创伤 感染 败 血症等 阴沟 肠 杆菌 (Enterobacter) 产 气杆菌 (E.aerogenes) 很少引起原 发 性感染 哈夫尼 亚 菌属 (Hafnia) 蜂 窝啥 夫尼 亚 菌 (H.alvei) 对 人无致病性 沙雷氏菌属 (Serrati) 粘 质 沙雷氏菌 (S.marcescens) 条件致病菌，引起泌尿系， 呼吸道及 创伤 感染 变 形杆菌属 (Proteus) 普通 变 形杆菌 (P.vulgaris) 食物中毒，泌尿系、呼吸道感染 等 耶 尔 森氏菌属 (Yersinia) 鼠疫耶 尔 森氏菌 (Y.pestis) 鼠疫 欧文氏菌属 (Erwinia) 草原居民欧文氏菌 (E.herbicola) 植物寄生菌，曾从人体 肠 道及化 脓 扁桃体中分离到 1、 粪 便 污 染的指 标 菌： 大肠菌群或大肠杆菌 二、 大肠菌群的测定意义 2、以大肠菌群作为粪便指标菌原因 1) 在粪便中数量最大； 2) 在外环境中存活的时间与致病菌大体相 同； 3) 检测方法简便容易。 3、 大肠菌群的测定意义 （ 1）、判断食品中否受到粪便污染。 （ 2）、有利于控制肠道传染病的发生和 流行。 （ 3）、有利于控制食品在生产加工、运 输、保存等过程中的卫生状况。 三、 大肠菌群的生物学特性 1.形 态 与染色：革 兰 氏染色阴性，无芽胞杆菌。 2.发酵乳糖产酸产气 3.培养特性：在琼脂上的典型菌落 :呈深紫黑色 或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光 滑，常有金属光泽； 在麦康凯琼脂上的典型菌落 : 呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。 EMB平板照片及原理 麦康凯琼脂平板 Age of culture is 24 h 大肠杆菌、大肠菌群选择性显色培养基 -COLI ID 用于在 37 下对食品中大肠菌群和大肠杆菌进行检测、计数及大肠杆菌的鉴定 本培养基含有两种显色物质，可以直接识别大肠菌群（ coliforms）和鉴定大肠杆菌（ Escherichia coli） ,而不需附加任何试剂。 菌落颜色 玫瑰红 蓝色 透明 . -葡萄糖苷酶 + - - . -半乳糖苷酶 + + - . 大肠杆菌 其它大肠菌群 其它革兰氏阴性菌 . -半乳糖苷酶（ +）大肠菌群存在 -半乳糖苷酶（ +）大肠菌群存在 -葡萄糖苷酶（ +）大肠杆菌存在 -葡萄糖苷酶（ -）无大肠菌群存在 大肠杆菌平板菌落照片 肠杆菌扫描电镜照片 . 四、 大肠菌群 检验方法及操作方法 国家标准： 三步法：乳糖胆盐发酵试验 分离培养 证实试验 (乳糖发酵试验 ) 行业标准： 两步法：推测试验 证实试验 检样 稀释处理 EMB等 革兰氏染色 乳糖发酵管 革兰氏阴性无芽胞 产气 革兰氏阳性 大肠杆菌阴性 大肠杆菌阴性 报告 不产气 乳糖胆盐发酵管 产气 不产气 大肠杆菌阴性 报告 报告报告 大肠杆菌阳性 1:100 1:10 各加入 1ml 各加入 10ml 各加入 1ml 单料乳糖 胆盐发酵 管 单料乳糖 胆盐发酵 管 双料乳糖胆 盐发酵管 初发酵 检样稀释 检样量 1g/ml 检样量 0.1g/ml 检样量 0.01g/ml EMB 分离培养 证实试验 乳糖发酵管 镜检 查 MPN表报告结果 表 1 粪大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征 培养基 菌落特征 伊红兰培养基 (EMB) 紫黑色、有金属光泽，紫黑色、不带或略带光泽，淡 紫红色、中心紫黑色、黑红或深紫红色 品红亚硫酸纳 (远藤氏平板 ) 紫红色、有金属光泽，深红色、不带或略带金属光泽 ，淡红色、中心较深 中国兰平板 深蓝色，浅蓝色、中心深蓝色 麦康凯平板 (Mac C) 桃红色，粉红色、中心桃红色 MPN法简介 The Most Probable Number Method 1g/ml检样中最近似值 (MPN)表 以 1、 0.1、 0.01、各用 3管。 阳性管数 MPN 个 /100 g/ml1g/ml3 0.1g/ml3 0.01g/ml3 0 0 0 30 0 0 1 30 0 0 2 60 0 0 3 90 0 1 0 30 0 1 1 60 0 1 2 90 0 1 3 120 0 2 0 60 0 2 1 90 0 2 2 120 0 2 3 150 0 3 0 90 0 3 1 130 0 3 2 160 0 3 3 190 五、粪大肠菌群的检验 粪大肠菌群 ： 系一群需氧及兼性厌氧，在 44.5 培养 24h内能发酵乳糖产酸产气和分 解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞 杆菌。 检验方法 检样 产酸产气 查 MPN表 报告 EMB 分离 靛质基试验 阳性反应 方法一： 45 EC肉汤发酵 稀释 44 乳糖胆盐发酵 方法二： 检样 稀释 36 乳糖胆盐发酵 产酸产气 产酸产气 EMB 分离 查 MPN表 报告 1、从制备样品匀液至稀释完毕 ,全过程不得超过 15min。 2、 对产 酸但未看到气泡的乳糖 发 酵，用手 轻 打 动 试 管，如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体 产生，应作进一步试验。 3、挑 选 菌落 进 行 证实试验时 ，最少要挑 2个以上的 典型菌落或非典型菌落进行接种。 4、不可用其他胆 盐 代替指定的胆 盐 。 六、检验注意事项 EMB平板照片及原理 靛基质试验原理及照片 七、 大肠菌群快速检验 食品 大肠菌群快速检验方法： TTC显色法； DC试管法； 纸片法。 （一）食品饮料大肠菌群快速检验纸片 使用方法： 1.样 品稀 释 同国 标 法 2.接种： 饮 料和 饮 用水采用原液、 1:10、 1:100三个稀 释度，固体食品采用 1:1 、 1:10和 1:100三个稀 释度。用 1亳升灭菌吸管吸取 1亳升同一稀释度 的稀释液均匀涂布到袋中的纸片上，做三个重 复。 3.培养： 将接种好的纸片轻轻压平（可叠放），在 36 下培养 15 24h观察结果。 4.结果判定 : 纸片上出现紫红色斑点 ,其周围有黄圈者 ,为 阳性 . 纸片为一种着色 ,无菌落生长者为阴性 . 纸片呈紫兰色 ,有紫红色斑点，其周围地黄 圈者阴性 . 酸性食品接种后 ,纸片变黄 ,经培养后无紫红 色斑点为阴性 （二）餐具大肠菌群快速检验 (纸片法 ) 使 用 方 法 ： 1. 采样 610 份。 碗、盘、杯等每份贴纸片两张 ， 用无菌生理盐水湿 润纸片后，立即贴于食具内侧表面， 30秒后取下， 置于原塑料袋内。筷子以 5只为一份样品，用吸管 吸取生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约 5cm）抹拭两张，放入原塑料袋内 。 2.将已采样的纸样置于 37C培养 15小时 . 纸片在黄色背景上出现红色斑点为阳性， 纸片在紫兰色背景上呈现红色斑点，但周 围没有黄晕均为大肠菌群阴性。同一份样 品两张纸片均是阴性为合格。 食品冷 饮 大 肠 菌群 检验纸 片 冷 饮 、乳制品和 调 味品等大 肠 菌群的 测 定 食品 饮 料大 肠 菌群快速 检验纸 片 饮 料、食用 纯 水和糕点的大 肠 菌群 测 定 餐具大 肠 菌快速 检验纸 片 餐具 卫 生消毒效果 检测 大 肠 菌群 测试 片 适用于需要对大肠菌群准确计数的样品，如消毒牛乳、 冷饮和调味品等。 八、水的大肠菌群检验 大 肠 菌群 MPN/100mL 细 菌 总 数 CFU/mL 生活 饮 用水 3 /L 100 瓶装 饮 用 纯净 水 3 20 饮 用天然 矿 泉水罐装 产 品 0 50 地面水 质 量 标 准 10000个 /L 准 备 加 氯 消毒后供 饮 用的水 1000 准 备 加 氯 消毒后供 饮 用的水 10000 游泳池水 100 1000 （一）、水样的采集 1、自来水（未含氯）：龙头火烧灭菌，畅流 5 10 后取 样 。 2、地面水源水：江湖河，水 库 ，水池等。浸入水下 20cm下取 样 。水井 50cm下取 样 。 3、漂白粉 处 理的水 样 ：自来水，游泳池水， 应 在瓶内加入 0.03g硫代硫酸 钠 /500ml，或 2ml 1.5%硫代硫酸 钠 液 /500ml，除 氯 。 4、运送： 2小时内送到检验室。 6 10 ， 6h,立即 检验 . 5、检验前：将水样振摇 5 10分 钟 。 （二）、生活饮用水或食品生产 用水的检验（ 大 肠 菌群 ） 各加 10ml 各加 100ml 水样 初发酵 三料乳糖胆盐50 毫升装 三料乳糖胆盐 5 毫升装 EMB分离 36 培养 24h 复发酵 乳糖发酵 镜检 36 培养 24h 大 肠 菌群 检索表（饮用水） 100ml阳性管数 10ml阳性管数 0 1 2 每 L水中 大 肠 菌群 数 0 3 4 11 1 3 8 18 2 7 13 27 3 11 18 38 4