防止蛀牙產品開發

蛀牙的元兇與形成原因 Streptococcus mutans 齟齒 (轉糖 )鏈球菌 利用葡萄糖傳遞酵素分解蔗糖 合成黏性 a-1,3-葡萄聚醣 吸引許多菌株共同形成牙菌斑 菌株分泌酸性物質侵蝕牙齒造成蛀牙 預防之道 : 干擾或抑制 牙菌斑的形成 防治對象 Streptococcus mutans 齟齒 (轉糖 )鏈球菌 策略 抗生素治療 (？ ) 抑制 a-1,3- 葡萄 聚醣生合成 水解 a-1,3- 葡萄聚醣 抗體中和 菌體 （？） 不同策略可能的執行方案與可能遭遇的困難 抗生素治療 u此細菌非生長於微血管可到達之組織或器官 ，口服或注射抗生素可以無法直接接觸到菌 體 u製成口含錠的抗生素？ u具有 a-1,3-葡萄聚醣保護菌體，抗生素不易 達到抑菌效果 抗體中和 u抗體專一性與菌體結合，透過吞嚥或飲食將 菌體帶離口腔 u以細胞外何種蛋白質製成抗體？ u抗體結合力足夠帶離菌體嗎？ 抑制 a-1,3-葡萄聚醣生合成 ua-1,3-葡萄聚醣生合成機轉 參與合成的酵素：葡萄糖傳遞酵素 利用此酵素分解蔗糖轉化成葡萄糖 u研發葡萄糖傳遞酵素抑制劑 如何篩選抑制劑（篩選方法的建立） 選殖葡萄糖傳遞酵素基因 建立表達系統、純化酵素 酵素活性分析方法的建立 酵素活性抑制效率的評估 選擇何種抑制物做測試？ 抑制物安全性評估 u減少蔗糖的供給（提供木聚糖取代蔗糖） 12 3 4 5 6 12 3 4 5 6 葡萄聚醣 (葡聚醣 )(聚葡萄糖 ) 葡萄糖單體以不同鍵結所形成聚醣 a-1,3-葡萄聚醣水解酵素水解 a-1,3-葡萄聚醣 葡萄聚醣水解酵素水解之葡萄聚醣鍵結不同區分為 b-1,3-glucanase (EC 9 (58) l真菌、某些藻類、 少數細菌 a-1,3-glucanase (EC 3.2.1. - ) l少數真菌、少數細菌 b-1,6-glucanase (EC 5) l真菌 b-1,4-glucanase (cellulase) (EC ) l植物 b-1,3-1,4-glucanase (EC (73) l大麥殼 如何篩選 a-1,3-葡萄聚醣水解酵素 ? 篩選可分解 a-1,3-葡萄聚醣的菌株 a-1,3-葡萄聚醣來源？ Aspergillus niger 黑麴菌細胞壁 以葡萄糖傳遞酵素合成 a-1,3-葡萄聚醣 篩選在培養皿可形成澄清環菌落（？） Enrichment medium 純化 a-1,3-葡萄聚醣水解酵素 酵素生化特性分析、生物活性分析 圖 : 標準菌株 Bacillus circulans WL-12 之 b-1,3-葡 萄聚醣水解酵素 基因選殖於大腸桿菌中在 活性培養基的表現 a-1,3-葡萄聚醣水解酵素基因選殖 建構基因庫 培養皿篩選可形成澄清環基因轉形株 (?) DNA定序確認 構築酵素大量表現質體 純化 a-1,3-葡萄聚醣水解酵素 酵素生化特性分析、生物活性分析 a-1,3-葡萄聚醣水解酵素 N端定序（？） （以蛋白酶水解成多片段做 N端定序） 純化蛋白質送 MALDI-TOF Mass or Tandem Mass 設計 degenernal primers 構築酵素大量表現質體 純化 a-1,3-葡萄聚醣水解酵素 酵素生化特性分析、生物活性分析 質譜術 質譜儀 化學分子離子化 帶電荷 外加電場 (動能 ) 真空管中飛行 撞擊偵測標靶產生訊號 (質量愈大飛行速度越慢 ) 飛行時間質譜儀 MALDI-TOF MS Tandem Mass 串連（陣列）質譜儀 分析蛋白質種類的方法 二維電泳 胰蛋白酶切 質譜儀分析 資料庫比對 利用氣體分子撞擊胺基酸片段 研究蛋白質體學的新興技術 成本高 普及率低 遺傳密碼 uN A, T, C, G uV A, G, C uH A, T, C uD A, T, G, uB T, G, C uW A, T uR A, G uM A, C uK T, G uY T, C uS G, C 混合核酸對照表 實作練習 N端定序序列為 M T L S S G K S N R 請寫所設計之 primers序列 另一股 primer? PCR產物不是全長 open reading frame Eukaryote: u5, 3 Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) Prokaryote ? / mRNA separation method Synthesis cDNA Cloning full-length cDNA molecular Vector system Host cell Insert capacity (kb) Plasmid E. coli 0.1 10 Bacteriophage / E. coli 10 20 Cosmid E. coli 35 45 Bacteriophage P1 E. coli 80 100 BAC E. coli 50 300 p1 Bacteriophage-derived artificial chromosome E. coli 100 300 Yeast artificial chromosome Yeast 100 2000 Human artificial chromosome Cultured human cells 2000 Cosmid Combine plasmid and bacteriophage Contain Cos (cohesive) sites Reference: /dana/250/25003_10.html 已有純化酵素如何選殖對應基因 真核生物：蛋白質水解成小片段，選兩段做 N 端定序，設計非一般性引子， PCR出某大小片 段，產物定序確認，再用 RACE技術從 mRNA 基因庫找出 5端和 3端 原核生物（細菌） u基因庫的建立 uColony hybridization 探針？可與真核生物相同策略，以 PCR產 物當探針 uReverse PCR ? u/ 篩到基因的機率 (原核生物 ) 公式： N = ln (1 -P) / ln (1 F/T) P is the desired probability (0.99) F is the fractional proportion of the genome in a single recombinant (5 kb) T genome size (5000 kb) N is the necessary number of recombinants N = ln (1-0.99) / ln (1 5/5000) = ln 0.01 / ln 0.999 = -4.6 / - 0.001 = 4600 若沒有全長基因如何解決？ 5端、 3端 RACE （ X） 以現有基因序列設計一探針 u篩選基因庫 （ bacteriophage construct） uReverse PCR 限制酶完全水解基因體 割膠回收 DNA片段 （切割成不同片段） 自接 self-ligation 使其形成 circle DNA 以反向 PCR放大 產物接 T-vector，定序確認 complete digestion chromosome DNA 切割成小片段回收 Self-ligat