色谱分析基础1

第九章第九章 色谱分析基础 高效液相 色谱 HPLC 气相 色谱 GC 本 章主要内容 色谱概述 色谱基本参数 塔板理论 速率理论 分离度 定性定量方法 历史 俄国植物学家茨维特在 1906年使用 的色谱原型装置 分离对象 -植物色素 色谱柱 - 玻璃管 固定相 - 碳酸钙 流动相 - 石油醚 色谱法起源色谱法起源 1931年 胡萝卜素植物色素分离 1936年 离子交换色谱建立 1940年 吸附色谱与电泳相结合 1941年 分配色谱创立 1952年 气相色谱法建立 1967年 高效液相色谱法建立 80年代 离子色谱、超临界流体色谱、毛细管电泳 色谱法发展历史色谱法发展历史 Tiselius, A.W.K. Martin, A.J.P. Synge, R.L.M. 1948年 Nobel 化学奖 1952年 Nobel 化学奖 吸附色谱与电泳 分配色谱 色谱法发展历史色谱法发展历史 色谱法概述色谱法概述 色谱法是一种物理化学分离色谱法是一种物理化学分离 方法，利用不同物质在两相方法，利用不同物质在两相 （固定相和流动相）中具有（固定相和流动相）中具有 不同的分配系数（或吸收系不同的分配系数（或吸收系 数，渗透性等），当两相做数，渗透性等），当两相做 相对运动时，这种物质在两相对运动时，这种物质在两 相中相中 反复多次反复多次 分配，从而使分配，从而使 各物质得到完全的分离各物质得到完全的分离 。 色谱法的分类 按流动相与固定相的分子聚集状态分类 气相色谱法气相色谱法 液相色谱法液相色谱法 超临界流体色谱法超临界流体色谱法 气固色谱法气固色谱法 气液色谱法气液色谱法 液固色谱法液固色谱法 液液色谱法液液色谱法 按操作形式分类 柱色谱法柱色谱法 平面色谱法平面色谱法 纸色谱法纸色谱法 薄层色谱法薄层色谱法 按分离机制分类 吸附色谱法吸附色谱法 分配色谱法分配色谱法 离子交换色谱法离子交换色谱法 空间排阻色谱法空间排阻色谱法 色谱法简单分类 气相色谱法气相色谱法 (GC) 液相色谱法液相色谱法 (LC) 超临界流体色谱法超临界流体色谱法 (SFC) 填充柱气相色谱法填充柱气相色谱法 毛细管柱气相色谱法毛细管柱气相色谱法 柱色谱法柱色谱法 平面色谱法平面色谱法 经典液相柱色谱法经典液相柱色谱法 高效液相色谱法高效液相色谱法 (HPLC) 薄层色谱法薄层色谱法 (TLC) 纸色谱法纸色谱法 (PC) 气相色谱 ( Gas chromatography ) 填充柱气相色谱 ( Packed column gas chromatography ) 毛细管气相色谱 ( Capillary column gas chromatography ) 裂解气相色谱 ( Pyrolysis gas chromatography ) 顶空气相色谱 ( Headspace gas chromatography ) 气相质谱联用 技术 ( Gas chromatography-Mass spectrometry ) 液相色谱 ( Liquid chromatography ) 高效液相色谱 ( High performance liquid chromatography ) 超临界流体色谱 ( Supercritical fluid chromatography ) 高效毛细管电泳 ( High performance capillary electrophoresis ) 毛细管电色谱 ( Capillary electrochromatography ) 液相质谱联用技术 ( Liquid chromatography- Mass spectrometry ) 色谱法分类 平面色谱法 ( Planar chromatography ) 薄层色 谱 (Thin layer chromatography) 薄层电泳色谱 (Thin layer electrophoresis) 纸色谱 (Paper chromatography) 色谱法分类 色谱法的特点 与其它分析方法相比，具有的优点： 分离效能高 灵敏度高？ 分析速度快 应用范围广 缺点：对未知物的定性比较困难 解决方法：与其它分析方法联用（质谱、红外和 电化学等） 高分离效能 高灵敏度 ? 在较短的时间内能同时分离和测定极为复杂的混在较短的时间内能同时分离和测定极为复杂的混 合物，如采用毛细管气相色谱柱分析合物，如采用毛细管气相色谱柱分析 40 150 汽油，汽油， 168 种组分可以在种组分可以在 110 min内一次进行分内一次进行分 离测定离测定 可以分析微量或痕量组分，如在大气污染物分析可以分析微量或痕量组分，如在大气污染物分析 中，甚至可测出中，甚至可测出 ppt级的微量毒物级的微量毒物 分析速度快 一般分析一次样品的时间为几分至几十分钟，一般分析一次样品的时间为几分至几十分钟， 某些快速分析，某些快速分析， 1秒可以分析秒可以分析 7个组分个组分 应用对象：气体和液体、有机物和无机物、 小分子和大分子等 应用领域：医药、化工、环保、食品、农药、 体育等 应用范围广 缺点：对未知物的定性比较困难 解决方法：与其它分析方法联用（质谱、红 外和电化学等） 色谱流出曲线 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的 最少 个数； 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析； 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析； 根据色 谱峰的保留值及其区域宽度，可以评价色谱柱分离效能； 根据色谱峰两峰间的距离，可以评价固定相（或流动相）选择是 否合适。 色谱基本参数 保留时间 tR 进样到出现色谱峰顶点的时间 保留体积 VR 进样到出现色谱峰最大时消耗 的流动相体积 死时间 t0 流动相流过色谱柱的时间 死体积 V0 色谱柱的空隙体积 校正保留时间 校正保留体积 保留值 基线： 无组分通过色谱柱时，检测器的噪音随时间变化的曲线 峰宽 Wb： 色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距 半峰宽 W1/2： 峰高一半处对应的峰宽 标准偏差 ： 正常色谱峰的两个拐点间距离的一半 相对保留值，选择性因子 ( ) 相对保留值 - 固定相 对 两种组分 的选择性 分配系数 K（热力学性质） 一定温度下，组分在 固定相 和 流动相 之间 分配达平衡时的浓度比。 K只与固定相和被分离物质的性质有关 K值的 差别是分离的先决条件， 差别越大，分离的可能性越大 K值大的组分后出峰 分配比（容量因子 )： 一定温度与压力下两相 达平衡后， 组分在固定相和流动相重量的比值 固定相重量 流动相重量 K与 k的关系： 容量因子 k与保留值的关系 : 色谱法基本概念 不能分离 不能完全分离 能完全分离 峰 之间的距离 -分配系数 （热力学） 峰 的宽窄 -柱效率 （动力学） 色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学 问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分 离度的评价指标及其关系。 组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？ 组分保留时间 ：色谱过程的热力学因素控制（组分和固定液 的结构和性质） 色谱峰变宽 ：色谱过程的动力学因素控制（两相中的运动阻 力，扩散） 两种色谱理论： 塔板理论和速率理论 色谱理论 塔板理论 - 柱效能指标 塔板理论 是色谱学中的热力学平 衡理论。它是把样品组分在色谱 柱中的分离过程，视为组分在分 馏塔里的分馏过程，把色谱柱看 成一个分馏塔。 分馏塔 利用各组分的沸点不同， 在塔板上经过多次气 -液平衡后 ，最终低沸点组分在塔顶流液的 含量高，高沸点组分在塔底层含 量高，而达到分离目的。 石油裂解产物 半经验理论 塔板理论的基本假设 (1) 色谱中也存在类似分馏装置的塔板。样品中的某组分 在色谱柱 “H”的高度区间内可以很快达到分配平衡。 H称 为理论塔板高度，且组分在 H高度内服从分配定律。 (2) 样品各组分开始时存在于第 0号塔板上，且试样沿色 谱柱轴 （ 纵 ） 向的扩散可以忽略不计。 (3) 流动相进入色谱柱（洗脱过程）不是连续的，而是间 歇进入，每次进入为一个塔板体积。 (4) 分配系数在所有塔板上都相同，与组分在塔板上的量 无关。 塔板理论 - 柱效能指标 色谱柱长： L 虚拟的塔板间距离： H 色谱柱的理论塔板数： n 则三者的关系为： 塔板理论 - 柱效能指标 理论塔板数与色谱参数之间的关系 (重点 ) tR: 保留时间 ; W1/2：半峰宽； Wb:峰底宽； H：理论塔板高度； L：色谱柱长度； n: 理论塔板数； n有效 ：有效理论塔板数； H有效 ：有效塔板高度 塔板数 n是色谱柱的特征参数。当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大 (塔板高度 H 越小 )，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。 不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效 塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。 柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数 K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。 塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实 验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径（实际应 用受到限制）。 塔板理论 - 几点说明 塔板理论的不足 塔板理论虽然指出了理论 塔 板数 n或理论 塔 板高度 H对色谱柱效率的影响，但是没有指 出影响 塔板高度 H的因素，因此无法在理论 指导下从实验上提高色谱柱的效率。 速率理论 - 影响柱效能的因素 速率方程（也称范 .弟姆特方程式） : H = A + B/u + Cu H： 理论塔板高度， u： 载气的线速度 (cm/s) A： 涡流扩散 系数 B： 分子扩散 系数 C： 传质阻力 系数 减小 A、 B、 C三项可提高柱效 , 存在着最佳流速 A、 B、 C三项各与哪些因素有关？ A = 2dp指 dp： 固定相的平均颗粒直径 ;： 固定相的填充 不均匀因子 细而均匀的颗粒，填充的越均匀， A， H， 柱效 n表现在 涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。 A 涡流扩散项 由于组分分子在色谱柱填充不均匀的固定相中移动途径不同 所造成的色谱峰展宽。 B = 2 Dg ： 弯曲因子，指填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素 Dg： 试样组分分子在流动相的扩散系数 (cm2s-1 ) 流速 ，滞留时间 ，扩散 B/u 分子扩散项 由于组分在液相中的扩散系数只有在气相中的 1/105，因此在 液相色谱中 B可以忽略。 由于组分在色谱柱中沿着柱长方向的扩散所致的浓度差而引 起的色谱峰展宽。 传质阻力包括气相传质阻力 Cg和 液相传质阻力 CL C = Cg + CL 扩散系数 D ， C , 分配平衡时间长，峰变宽 ,减小担体粒 度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。 C u 传质阻力项 指组分在色谱柱流动相和固定相之间的传递过程（溶解或吸 附等）存在不同的阻力而形成的色谱峰展宽。 载气流速与柱效 最佳流速 载气流速高时： 传质阻力项是影响柱效的主 要因素， 流速 ，柱效 。 载气流速低时： 分子扩散项成为影响柱效的 主要因素， 流速 ， 柱效 。 H - u曲线与最佳流速： 由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响 使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流 速的一阶导数有一极小值。 以塔板高度 H对应载气流速 u作图，曲线最低点的流速即 为 最佳流速 。 速率理论要点总结 (1)组分分子在柱内运行的 多路径与涡流扩散 、 浓度梯度所 造成的 分子扩散 及 传质阻力 使气液两相间的分配平衡不能瞬 间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。 (2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载 气流速可提高柱效。 (3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。 阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。 (4)各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影 响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使 柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的 影响；选择最佳条件，才能使柱效达到最高。 影 响谱带展宽的柱外效应 进样器死体积大、进样量大，进样速度慢 柱前后连接管道死体积大 检测器死体积大 分离度 塔板理论 和 速率理论 都难以描述难分离物质的实际分离 程度。即柱效为多大时，相邻两组分能够被完全分离。 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合 影响：保留值之差 色谱过程的热力学因素； 区域宽度 色谱过程的动力学因素。色谱分离中的 四种情况如图所示： 柱效较高， K(分配系数 ) 较大 ,完全分离； K不是很大，柱效较高， 峰较窄，基本上完全分离； 柱效较低， K较大 ,但分离 的不好； K小， 柱效低，分离效果 更差。 分离度的表达式 R=0.8： 两峰的分离程度可达 89%； R=1： 分离程度 98%； R=1.5：达 99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。 定义：相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱 峰底宽总和之半的比值。 分离度与基本色谱分离方程式 分离度 R 的定义并没有反映影响分离度的各种因素。 实际上，分离度是受柱效 ( n ) 、选择因子 ()和容量因 子 ( k )三个参数的控制。 上式即为基本色谱分离方程式 , 也可表示为 : 同理 , 可得 : 也可表示为 : 分离度与基本色谱分离方程式 提高分离度的途径 (1) 提高柱效 (1)增加柱长 : n增加 2倍时 R只增大 1.4倍 (2)降低塔板高度 H: 是提高分离度的最好方法 (3)采用直径较小、粒度均匀的固定相 (4)控制较薄的液膜厚度 (5)选择适宜的流动相、流速和温度等 提高分离度的途径 (2) 增大容量因子 k R 随 k 增大而增大，但是分析时间也随之延长 为了增大 k值，可采用的方法： （ 1） GC: 增加固定液的用量，适当降低柱温 （ 2） LC: 适当采用极性较小一些的流动相 提高分离度的途径 (3) 增大选择性因子 值 由于 的微小变化，都对 R有很大的影响， 增大 值是改善分离度的最有力的手段 为了增大 值，可采用的方法： （ 1） GC: 适当降低柱温 （ 2） LC: 通过控制固定相和流动相的性质来调 整 存在的问题： 的变化不像 n和 k有规律可循 色谱定性定量分析 一、定性分析 1、与纯物质直接对照定性 （ 1）利用保留值定性 （ 2）利用加入纯物质峰高增加定性 2、利用文献保留数据定性 （ 1）利用相对保留值定性 （ 2）利用文献保留指数定性 3、利用保留值的经验规律定性 （ 1）利用碳数规律定性 （ 2）利用沸点规律定性 4、与质谱、红外光谱联用定性 定量分析依据 i 为组分 i的质量； Ai为组分 i的峰面积； i为 组分 i的响应值； fi为 组分 i的绝对校正因子。 峰面积的测量： 峰面积的测量方法 （ 1） 峰高乘半峰宽法 ( 对称峰面积） （ 2） 峰高乘平均峰宽法 （不对称峰面积） （ 3） 剪纸称重法 （ 4） 自动积分法 （ 5） 峰高定量法 真实面积 （乘 1.065） 相对面积 （峰高乘半峰宽） 峰高 0.15和 0.85处的峰宽平均值乘峰高 定量校正因子 （ 1）绝对质量校正因子 （ 2）相对质量校正因子 i 为组分 i的质量； Ai为组分 i的峰面积； As为标准物 S的峰面积； fi为 组分 i的绝对校正因子； fs 为标准组分 S的绝对校正因子 ; Fi/s为相对质量校对因子 为使检测器产生的响应信号 能真实地反映出物质的量 比例系数 f i ：绝对校正因子为 单位面积对应的物质量 相对校正因子的测量 准确称取 被测组分和标准物质，混合后在一定色谱条件下， 准确 进样，分别 准确测量 相应的峰面积，根据上式计算。 相对响应值 相对响应值指组分 i与 等量 标准组分 S的响应值之比，它 与相对校正因子互为倒数 (Si = Ai/As)。 f i = 1 / Si 几种常用的定量方法 归一化法： 以试样中所有组分含量之和为 1，测定计算 被测组分含量的定量分析方法。 所有物质都出峰，且含量都在同一数量级上 Fi为组分 i的相对质量校对因子； Ai为组分 i的峰面积； ci为试样中组分 i的百分含量。 内标法 定义： 以样品中不含的标准品（内标物），加到样品中作对照物 质，对比求算待测组分含量的方法。 如何操作： 在用内标法做色话定量分析时，先配制不同重量比的 被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量 比和面积