rp-hplc-elsd法同时测定保健食品中酸枣仁皂苷a和b的含量

RP-HPLC-ELSD 法同时测定保健食品中酸枣仁皂苷 A 和 B 的含量 朱国健 1，魏锋 2，林瑞超 2 （ 1 正大青春宝药业有限公司， 杭州 200023； 2 中国药品生物制品检定所中药室，北京 100050） 摘要 目的：建立测定保健食品中酸枣仁皂苷 A 和 B 的高效液相含量测定方法。 方法：色谱柱 Agilent zorbax C18（4.6 mm250mm,5m）,柱温 25 ；流 动 相 0.5%冰 醋 酸 -甲 醇 （ 32： 68） ， 流 速 1.0 mLmin-1；蒸 发 光 散 射 检 测 器 ， 飘 移 管 温 度 105 ,氮 气 流 速 2.4 L/min。结果：酸枣仁皂苷 A 和 B 的线性范围 分别为 4.3739.2g 和 4.2538.6g；加样回收率（ n =5）分别为 96.35% 和 97.12%。结论：本方法简便、灵敏、准确，可用于含酸枣仁保健食品中以上 两种成分的含量测定和产品质量控制。 关键词：RP-HPLC-ELSD；酸枣仁皂苷 A 和 B； 含量测定 RP-HPLC-ELSD determination of Jujuboside A and B in functional foods ZHU Guo-jian1, WEI Feng2，LIN Rui-chao 2 （1 Chiatai Qingchunbao Pharmaceutical Co., Ltd. ,Hangzhou 200023； 2 National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products， Beijing 100050） Abstract Objective: To develop an RP-HPLC-ELSD method for determination of A and B in functional foods. Methods: An Agilent zorbax C18 column （4.6 mm250mm,5m）was applied; a mobile phase composing of methanol and 0.5% acetic acid (68:32) was used, and the flow rate was 1.0 mlmin-1; A ELSD detector was applied, and the tuber temperature was set at 105 , and the gas flow rate was set 2 at 2.4 L/min. Results：The results were obtained that quantitative line range of two ingredients was 4.3739.2g and 4.2538.6g respectively, and the average recovery （ n=5） was 96.35% and 97.12% respectively. Conclusion：A specific, sensitive, simple and reproducible RP-HPLC-ELSD method was established for the determination of the two ingredients in functional foods that claimed containing Spina Date Seed (Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H. F. Chou). Key words：RP-HPLC-ELSD; Jujuboside A and B; quantitative determination 酸枣仁为我国传统中药，具有补肝宁心，敛含生津的功效，常用于虚烦不 眠、惊悸多梦等症状。酸枣仁因其安全性和功效性均得以长期的临床实践肯定， 因此我国卫生部将其列入药食同源的原料名单。近年来，酸枣仁被广泛应用于 保健食品中，我国目前市场上有许多以酸枣仁为原料的保健食品。实验证明， 酸枣仁中的主要特征性功效成分为酸枣仁皂苷 A 和 B，因此，这两个成分常作 为指标成分被用于含酸枣仁的中药或保健食品的质量控制。 我国市场上有关酸枣仁皂苷 A 和 B 类成分的提取物、进口或国产保健食品 名目繁多，质量参差不齐。目前,有关中药中酸枣仁皂苷类成分的化学研究和含 量测定报道较多 1-3，而保健食品中酸枣仁皂苷 A 和 B 的含量测定方法文献报 道很少，归纳起来主要的分析方法有比色法、薄层扫描法和高效液相色谱法 4-6， 其中以高效液相色谱法测定较为准确，但由于酸枣仁皂苷 A 和 B 的紫外吸收很 弱，因此，用常规的 HPLC-UV 方法虽有文献报道，但检测灵敏度很低。反相高 效液相色谱蒸发光散射检测法（RP-HPLC-ELSD）是近年来常用的适合于没 有紫外吸收成分的检测方法，文献已有报道用于酸枣仁皂苷的检测，但这些方 法大多数只报道了测定其中 1 个成分的含量，不能较为全面地反应产品的真实 质量 7-9。另外，我国目前还没有用于测定食品或保健食品中酸枣仁皂苷 A 和 B 含量的国家标准或方法，为了更好的评价和控制产品的质量，我们收集了国 内市场上常见的几种含酸枣仁的保健食品，建立了用 RP-HPLC-ELSD 同时测定其 3 中的主要成分酸枣仁皂苷 A 和 B 两种成分的方法，并取得了满意的结果。 1 仪器与试剂 Waters2695 高效液相色谱仪，ALLTECH 2000 型蒸发光散射检测器。酸枣仁 皂苷 A 和 B 对照品均购自北京禾境科技发展中心,纯度均大于 99%。实验所用甲 醇为色谱纯，其他溶剂为分析纯，水为纯净水，过 Millipore 0.22m 滤膜。 含酸枣仁保健食品样品共 4 个品种均为市售。 2 色谱条件 色谱柱 Agilent zorbax C18（4.6 mm250mm,5m）,柱温 25 ； 流 动 相 0.5%冰 醋 酸 -甲 醇 （ 32： 68） ， 流 速 1.0 mLmin-1；蒸 发 光 散 射 检 测 器 ， 飘 移 管 温 度 105 ,氮 气 流 速 2.4 Lmin-1。 ； 理 论 塔 板 数 按 酸枣仁皂苷 A 计 算 不 低 于 2000。 色 谱 图 见 图 1。 Mv0.20.40.60.80.1. 分.2.04.06.08.010.12.014.016.018.020.2.024.0 A 1 2 4 Mv0.10.20.30.40.50.60. 分.2.04.06.08.010.12.014.016.018.020.2.024.0 B 1、酸枣仁皂苷 A（Jujuboside A） 2、酸枣仁皂苷 B（Jujuboside B） 图 1 对照品(A)和样品(B)色谱图 Fig 1 HPLC chromatogram of reference standards (A) and sample (B) 3 溶液的制备 3.1 对照品溶液 分别精密称取酸枣仁皂苷 A 和 B 对照品适量，加甲醇溶液分 别配制成酸枣仁皂苷 A 为 1.08 mgmL-1、酸枣仁皂苷 B 为 1.03 mgmL-1的溶 液，作为对照品溶液。 3.2 供试品溶液 分别精密秤取样品（市售含酸枣仁类保健食品） 2 g 于索氏 提取器中，加 50ml 石油醚，水浴加热提取 2 小时，弃取石油醚，再用 50ml 甲 醇索氏提取 3 小时，收集甲醇提取液，回收甲醇并定量转移至 10ml 的容量瓶中， 用甲醇定容，充分摇匀，过 0.45m 的微孔滤膜，作为供试品溶液。 4 方法与结果 4.1 线性关系考察 分别吸取对照品溶液 2.0，4.0，8.0，10.0，15.0，20.0L，注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰 面积对数值为纵坐标，进样量对数值为横坐标，计算其回归方程。结果表明酸 枣仁皂苷 A 在 4.3739.2g 范围内线性关系良好，回归方程为 Y=1.023105 X1.02910 2，r=0.9993；酸枣仁皂苷 B 在 4.2538.6g 范围内线性关系良 1 2 5 好，回归方程为 Y=1.065105 X1.30710 2，r=0.9991。 4.2 稳定性试验 精密吸取供试品溶液 10L，每隔 2 h.进样一次，共 6 次， 测定峰面积，结果酸枣仁皂苷 A 和 B 的 RSD 分别为 0.96%和 0.92%，表明 12h 内 测定结果稳定。 4.3 精密度实验 分别精密吸取对照品溶液 10L，注入液相色谱仪，测定峰 面积，结果酸枣仁皂苷 A 和 B 的 RSD 分别为（ n5）0.98%和 1.08%，表明仪器 精密度良好。 4.4 最低检测限和定量限 以信噪比 3:1 为标准测得酸枣仁皂苷 A 和 B 的最低 检测限分别为 0.63g 和 0.85g。以信噪比 10:1 时的进样量作为定量限, 测 得酸枣仁皂苷 A 和 B 的定量限分别为 2.11g 和 2.73g。 4.5 重复性实验 取同一样品 5 份，按样品处理方法平行提取并同法测定两种成 分的含量，求出测得值的 RSD。酸枣仁皂苷 A 和 B 的 RSD 分别为 1.16%和 1.22%,表 明本法重复性良好。 4.6 回收率试验 采用加样回收率实验方法。分别精密秤取已知含量的 1 号样品 1g 共 9 份，每 3 份 1 组，按高、中、低 3 个水平分别精密加入一定量对照品 （相当于样品中各成分含有量的 80%，100%，120%） ，按“3.2”供试品溶液制 备项下操作，结果酸枣仁皂苷 A 的回收率为 96.35% （RSD 1.17%） ，酸枣仁皂 苷 B 的回收率为 97.12% （RSD 1.13%） 。结果表明，以本法同时测定酸枣仁皂 苷 A 和 B 中两种成分，其回收率结果良好。 4.7 样品测定 按“3.2”项下方法制备样品溶液并测定，4 个品种酸枣仁类保 健食品（样品均为市售含酸枣仁保健食品不同生产企业的产品，分别编号 1，2，3，4）样品的测定结果见表 1。 表 1 不同样品中酸枣仁皂苷 A 和 B 两种成分的含量（%） Tab 2 The content of Jujuboside A and B in different products（%） 6 5 讨论 5.1 酸枣仁皂苷属于皂苷类成分，考虑到其化学特性和分析检测的灵敏度及准 确度，本实验使用蒸发光散射检测器，并比较了在不同流速(2.0, 2.2, 22.4, 2.6, 2.8 Lmin-1 ) 和不同温度( 90, 100, 105, 110, 120 )条件下的信 号响应,发现随着雾化气流速的增大以及漂移管温度的升高, 噪声响应明显降低,但 成分信号的响应强度同时降低。本文最后确定检测器漂移管温度设为105，氮 气流速设为2.4 Lmin -1较适宜。 5.2 经试验研究后认为采用流动相为甲醇-0.5%冰醋酸（68 :32），柱温25， 流速为1.0 mlmin -1 既可使酸枣仁皂苷A和B成分与其它成分有效分离,又可使保 留时间缩短,一般一个样品可在20min 内完成。 5.3 本实验旨在研究建立含酸枣仁皂苷 A 和 B 成分的保健食品功效成分的含量 测定方法，以制定该类产品的质量标准。从测定结果可以看出不同企业生产的 同类产品酸枣仁皂苷 A 和 B 成分的含量差别很大，因此反映出目前市场上该类 产品的质量良莠不齐的现状。另外，含量测定方法学实验结果表明，本法操作 简单，测定结果准确，具有良好的重复性，可用于含酸枣仁保健食品的质量控 制。 参考文献: 1 化学工业出版社，中华人民共和国药典 2005 年版一部，P254 2 万青. 养心安神 莫忘酸枣仁. 药膳食疗,2004,(07)：37 3 梁柱华,杨建设,杨艺虹,张珩,张秀兰,. 酸枣仁中总黄酮的含量测定研究. 分 析测试技术与仪器 , 2008, (01)34-37 样品编号 No. 酸枣仁皂苷 A ( Jujuboside A ) 酸枣仁皂苷 B ( Jujuboside B) 1 0.21 0.13 2 0.49 0.36 3 0.08 0.03 4 0.52 0.31 7 4 周庆武,李玲玲,纪标,徐垣义,. 反相高效液相色谱法测定酸枣仁颗粒中酸枣 仁皂苷 A 与酸枣仁皂苷 B 的含量. 时珍国医国药 , 2008, (03)：718-719 5 于莲,于敏,焦淑清. 睡安口服液中酸枣仁皂苷 A 和酸枣仁皂苷 B 的含量测定. 黑龙江医药科学 , 2006, (04)