5hla-a 、b血清学分

中国输血协会第四届输血大会 杭州 2006 年 5 月 11 日13 日 投稿登记表 作者或联系者资料 姓名傅 敏性别女职称助理研究员单位和职务上海市血液中心免疫遗传室 单位地址上海市虹桥路 1191 号邮编 200051 电话（区号 021）62758027 传真 62092413 手机 电子邮件 xiaoyixu317 稿件分类编号 6 投稿方法 投稿者请于 2006 年 3 月 15 日前将填写完整的投稿登记表连同论文摘要（粘贴或 打印在右侧的表格）传真至大会秘书处（057185065851），同时，另需将论文全文及摘 要电邮到 lwtg。科学、教育委员会将对投稿论文摘要进 行审阅，并于 2006 年 4 月 10 日前通知作者录用与否。被录用的稿件将根据评审专家的意 见以及作者的意 愿选择部分作为大会口头发言。被 录取的论文摘要将推荐在中国输 血杂志增刊中发 表，由中国输血协 会授予论文证书 。大会 闭幕后会将优秀论文摘要推荐 给中国输血杂 志编辑部，由 编辑 部筛选、 审稿后，将刊登文章全文。 若稿件被录用： 希望口头发 言 不希望口头发言 稿件要求 论文摘要打印或粘贴在规定的框内（高 16 厘米，宽 12 厘米），600 字左右。稿件内 容分类见会议预通知。 . 稿件格式题目，作者（希望作为 口头发言者， 请在方格内打 ），单位，目的，方法，结 果，结论； . 打印字体中文：宋体四号，全角；字间距：标准；单倍行距；段落间不空行。 被录用为口头发言的来稿应由作者或其代表根据大会秘书处的通知在相应的分组 活动中发言，作者自 备中文投影（或幻灯）。 论 文 摘 要 HLA-A 、B 血清学分型与基因分型结果的比较 傅敏 杜可明 季芸 杨剑豪 嵇月华 孙继丽 孙瑛 金晔 张铮 谢 军华（上海市血液中心 200051） 摘要：目的：分析血清学分型和基因分型对 HLA- A、B 分型结果的差异。 方法：采用 PCR-SSO 方法对 需骨髓移植的病人进行 HLA-A、B 基因分型，同时用 微量淋巴细胞毒试验进行血清学分型。 结果：691 例 样本中有 88 例血清学分型与 PCR-SSO 分型不符 （12.74%） ，其中 2 例 A、B 都不符合，19 例 HLA-A 不符（2.75%）：假阴性 7 例（1.01%） ；假阳性 4 例 （0.58%） ；错误指认特异性 8 例（1.30%） 。71 例 HLA-B 不符（10.27%）：假阴性 17 例（2.39%） ；假 阳性 15 例（2.17%） ；错误指认特异性 39 例（5.64% ） 。 结论：与基因分型相比较，HLA-A、B 血清学分型结 果存在错误，基因分型结果比血清学分型的更准确。 HLA-A 、B 血清学分型与基因分型结果的比较 傅敏 杜可明 季芸 杨剑豪 嵇月华 孙继丽 孙瑛 金晔 张铮 谢军华 上海市血液中心 上海 200051 摘要：目的：分析血清学分型和基因分型对 HLA-A、B 分型结果的差 异。 方法：采用 PCR-SSO 方法对需骨髓移植的病人进行 HLA-A、B 基因分型，同时用微量淋巴细胞毒试验进行血清学分型。 结果：691 例样本中有 88 例血清学分型与 PCR-SSO 分型不符（12.74%） ，其中 2 例 A、B 都不符合，19 例 HLA-A 不符（ 2.75%）：假阴性 7 例 （1.01%） ；假阳性 4 例（0.58%） ；错误指认特异性 8 例（1.30%） 。71 例 HLA-B 不符（10.27%）：假阴性 17 例（ 2.39%） ；假阳性 15 例 （2.17%） ；错误指认特异性 39 例（5.64%） 。结论：与基因分型相比 较，HLA-A、B 血清学分型结果存在错误，基因分型结果比血清学分 型的更准确。 关键词：HLA-A、B ；PCR-SSO；血清学分型 Comparison of the results of genotyping and serological typing in HLA class A/B LOCUS Abstract: Objective: To analyze the discrepancy between the results of molecular and serological HLA-A、B typing. Method: HLA-A、B alleles of patients who need to marrow transplant were genotyped using the PCR- SSO (sequence specific oligonucleotide) method, and compared with the results of serological typing. Results: 88 of the 691 individuals showed a discrepancy, account for 12.74%, 2 of 88 samples showed both an HLA-A and an HLA-B discrepancy. 2.75% of the discrepancies at the HLA-A locus， 1.30% by antigen misassignments，1.01% by false negative and 0.58% by false positive. 10.27% of the discrepancies at the HLA-B locus， caused partly by antigen misassignments ，account for 5.64%, partly due to false negative and false positive， account for 2.39% and 2.17% respectively. Conclusion: Compared to HLA A、B genotyping, the results of HLA-A、B serological typing were incorrect, genotyping was more accurate than serological typing. Key words: HLA-A、B；PCR-SSO ；serological typing. HLA-? 区位于第 6 号染色体短臂上，它的外显子编码 HLA-I 类分 子重链的 1，2 和 3 功能区，具有高度的多态性。已命名的 HLA- A 位点 349 个，B 位点 629 个；相应血清学特异性 A 位点 28 种，B 位点 59 种 1。HLA 配型是骨髓移植挑选供者必须进行的检查项目。 HLA-I 类抗原与移植排斥反应有很强的关联，分型结果正确与否直接 影响了移植物的存活、移植后的并发症和移植成功率 1。本文旨在比 较血清学分型和基因分型的结果差异，分析血清学结果的错误率。 1. 材料与方法 1.1 标本来源 2000 年 1 月至 2003 年 6 月，上海各医院送检的临床组织配型患 者共计 691 名 1.2 HLA-AB 基因分型 1.2.1 DNA 提取 采集 EDTA 抗凝的外周血 5ml，用 QIAGEN 试剂盒（GmbH 公司， 德国）提取的 DNA 终浓度调整为 3050ng/l，1.71.9 1.2.2 基因扩增与分析 采用 SSO 分型试剂盒（DYNAL 公司，美国） ，按说明操作。扩 增产物杂交后进行仪器判读。 1.3 HLA-AB 血清学分型 微量淋巴细胞毒试验：取抗凝血样 5ml 用 PBS 1:1 稀释，用淋巴 细胞分离液分离出白膜层，然后用 PBS 洗涤 2 次后，加入 Terasaki 保存液 2-3 滴，最后按 One Lambda 公司的血清学分型盘说明书进行 抗原抗体反应，显微镜下计分。 2 结果 2.1 691 例需骨髓移植的样本中有 88 例血清学分型与基因分型结果不 符，占 12.74% 2.2 血清学结果错误中，HLA-A 假阴性（未能检出某抗原） （7/691） 占 1.01%，假阳性（4/691）占 0.58%， （见表 1） 2.3 血清学结果错误中，HLA-B 假阴性（17/691）占 2.39% ，HLA-B 假阳性（15/691）占 2.17% ， (见表 1) 2.4 血清学错误指认特异性 HLA-A（8/691）占 1.30%，HLA- B（ 39/691）占 5.64%（见表 2） 2.5 HLA-B 的错误率比 HLA-A 高，为 HLA-A 的 2.11 倍 表 1 HLA-A B 假阴性及假阳性次数(n=691) A 位点 假阴性 假阳性 B 位点 假阴性 假阳性 A1 1 B18 1 A2 3 B21 1 A11 1 B27 1 A24 2 B37 1 A30 1 B38 1 A31 1 B46 2 1 A68 1 B47 1 A69 1 B48 1 B49 1 B51 2 B52 1 B53 1 B55 1 B61 2 9 B62 1 B71 1 B75 2 B76 1 表 2 部分错误指定特异性情况 血清学 A 位点 基因 A 位点 血清学 B 位点 基因 B 位点 3 33 3 30 27 58 27 62 2 31 2 30 27 62 27 62 11 23 11 24 7 55 7 55 2 24 24 3 7 35 7 35 23 31 31 24 35 46 35 46 31 11 11 30 13 55 13 55 2 24 2 34 13 46 13 46 2 31 31 3 13 52 13 52 2 33 2 33 58 61 58 60 2 11 2 11 48 60 48 61 2 - 2 - 48 75 75 81 3 33 3 30 27 58 27 62 2 33 2 33 58 75 58 46 2 29 2 29 7 60 60 81 2 24 2 24 48 60 48 61 2 - 2 - 38 51 51 67 2 24 2 24 38 62 62 39 2 - 2 - 38 61 61 39 11 - 11 - 51 60 51 61 2 11 2 11 60 75 60 46 2 11 2 11 54 67 54 55 31 33 31 33 38 75 75 18 2 11 2 11 54 71 54 63 24 26 24 26 44 54 44 55 2 24 2 24 54 59 54 67 24 - 24 - 60 61 61 48 11 24 11 24 27 60 27 61 2 24 2 24 35 51 51 75 31 33 31 33 75 51 51 62 11 33 11 33 58 61 58 60 3 11 3 11 35 59 35 62 2 26 2 26 52 55 52 62 24 33 24 33 40 58 58 61 26 32 26 32 52 61 61 51 11 24 11 24 35 75 75 51 11 33 11 33 39 55 39 71 26 31 26 31 51 72 51 62 24 30 24 30 35 60 60 53 1 26 1 26 62 77 62 49 注：斜体为基因分型与血清学分型方法结果的差异 3 讨论 HLA 配型是骨髓移植挑选供者必须进行的实验。HLA-I 类抗原与移植排斥反 应有很强的关联，分型结果正确与否直接影响到移植后的成功率和并发症 2。自 1964 年以来，HLA-A 、B 的分型一直用微量淋巴细胞毒试验。但由于血清学分型 方法本身的局限性，例如难鉴定出所有 WHO 认可的特异性，难获得高质量单特 异性抗血清；结果易受到交叉反应、细胞活力低、细胞表达水平、人种和民族背 景、人为误差等因素的影响 3 ，限制了它的进一步使用。因此，近年来国内外对 HLA-A、B 分型逐渐转向 DNA 分型。PCR-SSO 技术以 DNA 为样本进行 HLA- A、B 分型，它的准确性高，需血量少，相关试剂为人工合成，不受稀有血清、 细胞活力和细胞表达水平的限制，相对快捷且易掌握因而被广泛应用。 本研究对 691 例病人样本同时进行 PCR-SSO 分型与血清学分型并将实验结 果进行比较。结果显示血清学误定型有 3 种类型：1.假阴性 2.假阳性 3.错误指认 特异性。HLA-A 、B 血清学分型与基因分型结果不相符 88 例次，其中 HLA-A 不 相符（19/691）占 2.75%，HLA-B 不相符（71/691 ）占 10.27%，HLA-A、B 均不 相符 2 例。在 HLA-A 不相符的 19 例中，假阴性（7/19 ）占 36.84%，假阳性 （4/19）占 21.05%，错误指认特异性（8/19）占 42.11%。在 HLA-B 不相符的 71 例中，假阴性（17/71）占 23.94%，假阳性（15/71）占 21.13%，错误指认特异性 （39/71）占 54.93%。与基因分型结果比较，国外文献报道 HLA-I 类血清学分型 不符合率为 5%-25%的 4 ，国内吴晓冬 5等报道 HLA-类错误率为 2%，武大林 6等 报道 HLA-A 错误率为 23.5%，B 错误率为 26.5%，本研究结果与国内外报道的基 本一致。 本实验血清学分型与基因分型不符合主要是错误指认特异性的因素（42.11% 与 54.93%） ，在 HLA-A 中假阴性的比率也颇高，达到了 36.84%。根据 HLA- A、B 各自数据来看，HLA-B 比 HLA-A 不相符率高（10.27%比 2.75%）此结论 与国外研究结果 7相符，这可能由于在血清学分型中，HLA-B 特异性种类多，分 布广，因此比 HLA-A 容易出现指定错误。血清学分型出现假阴性的原因一般有 以下几种：试剂抗血清没有和抗原反应；使用的其它试剂没有和抗原反应； 目的抗原被同一交叉反应组内另一抗原掩盖；细胞活力较低，影响实验结果。 在本研究中容易出现假阴性的抗原是 A2、A24、A1、A69、 B61、B52、B51 等。 而假阳性容易出现的抗原是 A11、A30、A31、A68、B61、B75 等（见表 1） 。 本实验中有 1 例样本由于细胞活力原因而将 B53 漏检。这可能是因为本实验 的 691 份样本均来自需骨髓移植的病人，所以不排除患者自身健康水平的因素和 在治疗过程中进行放、化疗等因素导致细胞免疫功能降低，致使 HLA 抗原表达 减弱， 。可见，血清学分型如果细胞活力受影响也会导致实验结果差错，重复性 较差，因此受自身因素如标本中细胞活力、数量、和药物使用等影响，对实验时 间、温度的限制也相对较多。 血清学分型出现假阳性的原因一般有以下几种：反应时间过长，细胞已 经死亡，血清质量问题引起的交叉反应。 本实验中容易出现假阳性的是 A11、A30、A31、A68、B61、B75 等，特别是 B61 达到 9 例次，其中有 5 例次 另一个 B 位点是 B60。在 HLA-B，B40 的裂解产物 B60 与 B61 有强交叉反应， 容易出现干扰。所以在错误指出特异性的比率中也以这两个位点最高， 类似情况也出现在 B15 的裂解产物 B62 与 B75 上。因此，在使用血清学方 法进行分型时，如果遇到此类容易发生错误的位点（见表 2） ，判读时应该注意， 如果条件允许，最好进行基因分型。 经过本次实验，充分证实与基因分型结果相比，血清学分型存在相当高的错 误率，如果仍然使用此分型技术势必会对供者筛选造成错误，而导致严重的后果， 因此若要提高准确率和可比性，就必须使用基因进行分型。但须提醒的是，基因 分型有时不能完全代表表型，而血清学复杂的反应格局能客观地反映不同 HLA 分子的表位 8，因此实际工作中应以基因分型技术和血清学分型方法相互结合， 互为补充。 参考文献 1. Schreuder GM, Hurley CK, Marsh SGE, et al. The HLA Dictionary 2004: a summary of HLA- A, -B, -C, -DRB1/3/4/5 and -DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR and -DQ antigens. Tissue Antigens 2005: 65: 155 2. Prasad V K, Kernan N A, Heller G et al. DNA typing for HLA-A and HLA-B identifies disparities between patients and unrelated donors matched by HLA-A and HLA-B se