芒柄花黄素对人膀胱癌细胞t739增殖、凋亡的影响及机制探讨

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 芒柄花黄素对人膀胱癌细胞 T739 增 殖、凋亡的影响及机制探讨 摘要 目的 观察芒柄花黄素对 人膀胱癌细胞 T739 增殖与凋亡的影响 及其机制探讨。 方法 分别采用 0、15、30、60 mol/L 的芒柄花黄素作 用 T739 细胞后，CCK8 法检测 T739 细 胞的增殖情况，流式细胞术检测凋亡率 的变化，Hoechst 33258 荧光染色法观察 凋亡情况，Western blot 检测 GSK- 3、Axin、-catenin 蛋白含量变化。 结果 15、30、60 mol/L 的芒柄花黄素 以浓度和时间依赖方式明显抑制 T739 细胞的增殖（P 中国论文网 /6/view- 12955634.htm 关键词 芒柄花黄素；T739 ；凋 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 亡；GSK-3；Axin；-catenin 中图分类号 R285.5 文献标识 码 A 文章编号 1673-7210（2017） 09（a）-0004-04 Abstract Objective To study the effect of formononetin on the proliferation and apoptosis of human bladder cancer cells T739 cells， and discuss the mechanism. Methods Different contents of 0， 15， 30， 60 mol/L formononetin were added to T739 cells. CCK8 assay was applied to determine the effect of formononetin on proliferation of T739 cells. Apoptosis was analyzed by flow cytometry and Hoechst33258 staining. The expressions of GSK-3， Axin and - catenin proteins in T739 cells were determined by Western Blot. Results Different contents of 15， 30， 60 mol/L formononetin treatments suppressed the proliferation of T739 cells in a time- or dose-dependent manner （P -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 98%） 、二甲基亚砜（DMSO，纯度 98%） 、 荧光染料 Hoechst33258 购自美国 Sigma 公司，RPMI-1640 培养基、胎牛血清购 自美国 Hyclone 公司，人膀胱癌细胞株 T739 由中科院上海细胞生物研究所提 供，实验所用 GSK-3、Axin、- catenin 一抗均购自美国 Santa Cruz Biotechnology 公司，辣根过氧化物酶 （HRP）标记的抗小鼠 IgG 二抗为北京 中杉金桥生物技术公司生产，CCK8 试 剂盒、V-FITC 凋亡检测试剂盒购自上 海碧云天研究所，总蛋白测定试剂盒购 自南京建成生物工程研究所，全自动酶 标板分析仪由美国 Bio-Rad 公司生产， FACSAria流式细胞仪由美国 BectonDickson 公司生产。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 人膀胱癌细胞 T739 在 37、5% CO2 环境下置于含 10%胎牛血清（FBS）和 100 U/mL 青霉 素、100 U/mL 链霉素的 RPMI-1640 培 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 养基培养。 1.2.2 药物配制 芒柄花黄素与二 甲基亚砜溶液配成浓度为 100 mmol/L 药液，置于 4冰箱避光保存，待使用 时以完全培养基按比例稀释成 0（对照 组） 、15、30、60 mol/L 浓度药液。 1.2.3 CCK8 法检测 T739 细胞的 增殖活性 取对数生长期 T739 细胞，以 细胞浓度 6103 个/孔，每孔 100 L 细 胞悬液接种于 96 孔培养板中，在细胞 培养箱内培养 24 h 后取出，弃培养液， 分别加入“1.2.2”项下浓度药液，每组设 5 个复孔。继续孵育 24、48、72 h 后， 避光每孔加入 10 L CCK8 溶液，继续 培养 2 h 后取出，酶标仪于 450 nm 波长 测定吸光度 OD 值，实验重复 3 次，结 果取算数均数。细胞增殖抑制率=（1- 实验孔平均 OD 值/对照孔平均 OD 值） 100%。 1.2.4 流式胞术检测 T739 细胞 的凋亡率变化 取对数生长期 T739 细胞 接种于 6 孔板。12 h 细胞贴壁后去上清 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 液，分别加入“1.2.2”项下浓度药液继续 培养 48 h 后用胰酶消化成单细胞悬液， PBS 清洗 3 遍，2000 r/min 离心 5 min， 之后弃掉上清液，每管加入 500 L 结 合缓冲液重悬细胞，再加入 5 L Annexin V-FITC 及 5 L Propidium Iodide，混匀室温避光反应 15 min，流 式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复 3 次，结果取算数均数。 1.2.5 Hoechst 染色观察 T739 细 胞凋亡情况 取对数生长期 T739 细胞接 种于 6 孔板，12 h 细胞贴壁后去上清液， 分别加入“1.2.2”项下浓度药液，继续培 养 48 h 后，弃培养基，加入 0.5 mL 固 定液，10 min 后弃固定液，PBS 清洗 2 遍，加入 0.5 mL Hoechst33258 染色液， 避光染色 5 min。在荧光显微镜下观察 细胞的形态（激发波长为 350 nm，发射 波长为 460 nm） ，实验重复 3 次。 1.2.6 Western blot 检测 T739 细胞 GSK-3、Axin、-catenin 蛋白表达 取 “1.2.2”项下浓度药液孵育 48 h 后的细胞， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 提取总蛋白，用考马斯亮兰法 （Bradford micro）测定样品蛋白浓度。 每孔 20 L 上样，浓缩胶电泳电压为 80 V，分离胶电压为 130 V，电泳 4 h 后， PVDF 膜半干转，时间为 1.5 h。用含 5%脱 脂奶粉的 PBS 液封闭 1 h，之后分别加 入 GSK-3、Axin、-catenin 抗体（抗 体稀释度 1500）4过夜，次日 TBS 洗膜 3 次，每次 10 min，洗膜后用 HRP 标记的二抗（抗体稀释度 15000）室 温反应 1 h，于暗室中用超敏化学发光 法曝光胶带。采用凝胶分析系统记录条 带光密度并且图像分析系统分析，以蛋 白条带的积分光密度值反映检测蛋白相 对强度。 1.3 统计学方法 采用 SPSS 19.0 统计学软件进行 数据分析，计量资料数据用均数标准 差（xs）表示，多组间比较采用单因 素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验，以 P 0.05 为差异有统计学意义。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 2 结果 2.1 芒柄花黄素对 T739 细胞增 殖的影响 与对照组相比，15、30、60 mol/L 的芒柄花黄素在分别作用 24、48、72 h 后，T739 细胞的增殖受 到不同程度抑制（P 0.05） ，增殖抑制 率随着药物浓度升高和时间延长而增加。 见表 1。 2.2 芒柄花黄素对 T739 细胞凋 亡的影响 相比对照组，15、30、60 mol/L 的芒柄花黄素作用 48 h 后 T739 细胞凋 亡率明显升高，呈浓度-效应关系（P 0.05） ，见表 2。Hoechst 33258 染色观察 发现，对照组和细胞核完整，形态饱满， 而药物组可见细胞核呈致密浓染，严重 时甚至裂解为碎块，产生凋亡小体。随 着药物浓度的升高，细胞的凋亡越明显， 呈剂量依赖性。见图 1。 2.3 芒柄花黄素对 T739 细胞 GSK-3、Axin、-catenin 蛋白表达的 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 影响 15、30、60 mol/L 的芒柄花黄 素处理 T739 细胞 48 h 后，GSK-3 的 表达水平分别上调至对照组的 （1.5300.034） 、 （2.1100.042） 、 （2.5000.047）倍（P 0.05） ，Axin 的 表达水平分别上调至对照组的 （1.3900.022） 、 （1.5710.027） 、 （1.7330.036）倍（P 0.05） ，而 - catenin 的表达水平分别下降到对照组的 （0.8900.024） 、 （0.6920.021） 、 （0.4910.023）倍（P 0.05） 。见图 2。 3 讨论 11 Yang Y，Zhao Y，Ai X，et al. Formononetin suppresses the proliferation of human non- small cell lungcancer through induction of cell cycle arrest and apoptosis J. Int J Clin Exp Pathol，2014，7 （12）：8453- 8461. 12 顾万，赵新阁，张幸.芒柄 花黄素通过调节 Bax 和 Bcl-2 蛋白表达 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 诱导 SKOV3 细胞凋亡J.四川生理科学 杂志，2014，36（2）：60-62. 13 Hu W，Xiao Z. Formononetin induces apoptosis of human osteosarcoma cell line U2OS by regulating the expression of Bcl-2，Bax and MiR-375 in vitro and in vivo J. Cell Physiol Biochem，2015 ，37（3）：933-939. 14 张世 O，张旭 .Wnt 信号通 路在肿瘤调控方面的研究进展J.中国 药理学通报，2017，33（1）：14-18. 15 Du Y，Wang Y，Zhang F，et al. Regulation of metastasis of bladder cancer cells through the Wnt signaling pathway J. Tumour Biol，2015，36（11）：8839-8844. 16 Huang H，He X. Wnt/beta- catenin signaling：new（and old） players andnew insights J. Curr Opin Cell Biol，2008， 20（2）：119-125. 17 Lustig B，Behrens J. The Wnt signaling pathway and its role in -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 tumor development J. 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