乳腺癌-基因治疗

乳腺癌基因治疗之综述 【摘要】乳腺癌是一种常见的妇科肿瘤，约占全身恶性肿瘤的 7% 10%，近 20 年来在我国的发病率逐渐升高，已严重威胁女性 健康，仅次于宫颈癌。针对早期（、期）乳腺癌的治疗方法有 外科手术切除、放疗、内分泌治疗以及使用抗肿瘤药物进行治疗 （如紫杉醇、维甲酸类等），但对晚期乳腺癌的治疗效果不佳。由 于肿瘤是一种多基因参与的分子疾病，基因治疗乳腺癌应能取得较 好的疗效。基因治疗的方式有两类 ：（1）基因矫正和置换；（2 ） 基因增补。目前研究的基因治疗方法主要有免疫基因治疗、癌基因 拮抗治疗、化学基因治疗（多药耐药基因治疗和自杀基因治疗）、 抗肿瘤血管形成基因治疗、使用溶瘤病毒的治疗等措施。 关键词：乳腺癌、分子机制、癌基因拮抗治疗、抑癌基因治疗、 免疫基因治疗、自杀基因治疗、多耐药基因治疗、抗肿瘤血管形成 基因治疗、溶瘤病毒的治疗 一、乳腺癌发病的分子机制 乳腺癌的发生是以多个原癌基因在不同的时间和空间上，经不 同途径激活或不同的抑癌基因失活为基础的多步骤过程。 1、原癌基因的改变 (1) HER-2（c-erbB-2,neu)大量研究结果表明 c-erbB-2 的扩增 及蛋白表达与组织学分级、淋巴结转移度、死亡率、复发率呈正相 关，与 ER、PR 的水平及患者生存期呈负相关，因此为临床提供了 更有说服力的判断乳腺癌预后的指标 Ras 基因 乳腺癌组织与正常乳腺组织 ras 激活水平时发现过半 数乳腺癌患者 ras 活性高于正常 (2) C-myc 基因 有 25%的乳腺癌患者有 C-myc 基因表达的改 变，主要是表达水平的异常增高，可能与乳腺癌的发展有关。 Naidu1等发现 C-myc 基因的过度表达与缺乏雌激素受体和乳腺癌 不良预后有关。 2、抑癌基因的改变 (1) P53，参与细胞周期和细胞增殖的调节，与乳腺癌的发生、 发展关系密切，与乳腺癌组织细胞类型、分化程度、临床分期、术 后复发有明显相关性。 (2) BRCA-1， 抑癌基因 BRCA-1 常存在突变，在大多数散发 性乳腺癌中表达往往过低。 (3) ING1 ，乳腺癌组织中 ING1 mRNA 的表达水平癌旁正常组 织。ING1 mRNA 表达水平低下可能与乳腺癌的发生有关。 二、乳腺癌的基因治疗 1 癌基因治疗 癌基因参与细胞的生长与代谢，这些基因在正常情况下不表达 或仅限量表达，当其被激活过表达时引起细胞癌变。目前研究表明， 癌基因 c-myc、erbB-2、bcl-2、成纤维生长因子等在乳腺癌中表达 3 增高，它们的过表达与乳腺癌的发生发展密切相关。针对癌基因的 治疗策略主要是抑制其表达。目前常用的方法有:( 1) 反义核苷酸、 核酸或 siRNA 阻止癌基因 mRNA 转录和翻译。有研究表明，对乳 腺癌细胞株 MCF-7 转染 ER-siRNA 48h 后，给予 KGF( Keratinocyte growth factor)处理 24h，结果显示 siRNA 转染后 ER- 的表达显著降低，KGF 介导的乳腺癌细胞的增殖也显著降低， 同时提示 ER- 的表达与 KGF 介导的乳腺癌的增殖有关。( 2) 以 显性负突变体干扰肿瘤细胞内信号转导。研究称在雌激素受体( + ) 的乳腺癌细胞中转入雌激素受体显性负突变体后能显著抑制乳腺癌 细胞的生长。( 3) 使用细胞内抗体预先占据胞内定位系统，隔离胞 内生长因子受体，从而阻止癌基因蛋白到达其适宜的细胞内靶位。 2 抑癌基因治疗 抑癌基因是指正常细胞内存在的、能抑制细胞转化和肿瘤发生 的一类基因群。目前已分离克隆的抑癌基因主要有 p53、 Rb、 ERBA、WT1 、DCC 、MCC、APC、nm23、MTS、TIM P、 FHIT、BRCA1 和 BRCA2 等。而以 p53、FHIT、BRCA1 和 BRCA2 等实验研究较多。现在常用的方法是以腺病毒为载体，将相 应的抑癌基因转染乳腺癌细胞，抑制乳腺癌细胞的生长。p53 基因 是研究较为深入的一种，野生型可直接抑制 DNA 复制，使细胞出现 G1 期阻滞可调控细胞凋亡。乳腺癌患者中有 40%出现 p53 基因的 缺失或突变。将野生型 p53 基因导入 p53 基因缺失或变异的乳腺癌 细胞，可抑制肿瘤细胞的生长 ,促使肿瘤细胞凋亡。在家族性乳腺 癌中发现的与其发病相关的抑癌基因 BRCA1 常存在突变 ,在大多 数散发性乳腺癌中表达往往过低。这一发现为将野生型 BRCA1 导 入乳腺癌细胞，恢复 BRCA1 功能的基因修复治疗乳腺癌奠定了理 论基础。目前有在乳腺癌动物模型中采用装有 BRCA1 的逆病毒载 体 ,瘤内直接注射的方法，将 BRCA1 用于晚期乳腺癌胸壁转移瘤 的治疗。Fragile histidine triad（FHIT）基因定位于染色体 3p14.2，是一种新发现的抑癌基因。FHIT 基因的大片段缺失常存在 于包括乳腺癌在内的许多肿瘤中。研究表明用腺病毒转染 FHIT（Ad-FHIT）后，可激活 caspase-2 并释放细胞色素 2，最终 导致乳腺癌细胞凋亡。 3 免疫基因治疗 1.1 细胞因子治疗 细胞因子调节多种细胞生理功能，是机体 防御和清除肿瘤的重要因子。肿瘤的发生与肿瘤患者的细胞因子表 达有关，因此, 通过细胞因子网络增强机体抗肿瘤免疫达到清除肿 瘤的目的，一直是该领域研究的一个热点。（1）将细胞因子基因导 入肿瘤细胞。将表达人源性肿瘤坏死因子 （hTNF-）基因的质粒 体外转染不同的乳腺癌细胞株（MDA-MB-361、HCT116、8-M G- BA）。检测结果表明 hTNF- 在 3 种细胞株中均有表达 , 可显著诱 导 MDA-MB-361 凋亡、坏死，对 HCT116 作用则较弱，而对 8-M G-BA 几乎无作用。动物实验表明 hTNF- 可在裸鼠体内引起 MDA- MB-361 坏 死。研究发现 DISC-hGMCSF 能够高效转染人乳腺癌 细胞，分泌 GM-CSF; DISC-hGMCSF、在 4T1 中可有效抑制肿瘤 5 生长，与化疗药物联合使用时效果不受影响；（2）将细胞因子受体 基因导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞表面相应的细胞因子受体表达增多， 从而将大大增强细胞因子的抗肿瘤效果。乳腺癌细胞表面表达 IL- 13 受体 2（IL-13R2） 后, 可提高其对 IL-13 的敏感性。将载 有 IL-13R2 的质粒皮下注入乳腺癌荷瘤小鼠体内，再在鞘内注射 IL-13 进行干预，取得了显著的抗瘤效果，且对动物其它重要脏器 无影响。病理结果显示，消退的瘤体内有大面积的组织坏死, 伴有 巨噬细胞和 NK 细胞的浸润。说明 IL-13 对肿瘤的直接毒性作用和 相关免疫反应的激活有关。 1.2 将癌特异抗原基因导入抗原提呈细胞 BA46 是乳腺癌相 关抗原，存在于多数乳腺癌细胞膜表面,但造血细胞表面无此抗原。 自身抗原不能刺激机体产生 CTL 反应。实验将载有 BA46 基因的 重组腺相关病毒载体转染树突状细胞，实验结果表明树突状细胞可 表达 BA46 抗原；树突状细胞 基因组整合 AAV/BA46/Neo 载体； 可刺激机体产生强烈、迅速的 BA46 抗原特异性、MHC-I 限制性 CTL 反应，但仅持续 1 周的时间；产生 IFN-T 细胞数量显著增多 而产生 IL-4T 细胞数量较低；树突状细胞高表达 CD80 和 CD86。 实验将带有 ErbB22neu 基因的腺病毒载体(AdNeuTK)转染树突状 细胞，小鼠动物实验发现，经 ErbB-2/neu 基因修饰的树突状细胞 疫苗能诱导抗肿瘤免疫反应，与 IL-12 联合应用抗肿瘤效果则更好。 1.3 肿瘤疫苗治疗 目前应用于临床试验的肿瘤疫苗治疗有以 下 2 种：（ 1）全肿瘤细胞疫苗 即采用转基因手段促进机体对肿 瘤细胞的免疫反应。将编码促进免疫反应的细胞因子的基因直接在 体内转染到肿瘤细胞内 。或在体外将这些基因转染到肿瘤细胞内， 在肿瘤细胞经放射线照射灭活后自身移植于体内，以增强免疫反应。 目前用于该方面研究的免疫增强细胞因子包括 IL- 2，IL-12，干扰素、 粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子(GM - CSF)等；（2 ）树突状细胞为 基础的肿瘤疫苗 具有强烈抗原提呈功能的树突状细胞也是免疫治疗 的靶目标，能够有效地将肿瘤抗原提呈传递给 CD4+和 CD8+细胞， 活化特异的 CTLs。 四、自杀基因治疗 自杀基因疗法的机制有：（1）直接杀伤作用 即转染了前药转 换酶基因的肿瘤细胞能将前药转变成细胞毒物质，从而直接杀伤肿 瘤细胞；（2 ）旁观者效应（ bystander effect）转染了自杀基因的 肿瘤细胞被杀死，其周围大量未被转染的细胞也被杀死的现象称为 旁观者效应。旁观者效应明显扩大了自杀基因的杀伤作用。由于基 因载体系统在体内的转染效率很低，自杀基因在体内对肿瘤直接杀 伤作用比较小，因而旁观者效应起着十分重要的作用。 目前用于乳腺癌治疗的自杀基因体系主要有以下几种：（1）单 纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK)基因/更昔洛韦 (GCV)系统 GCV 是阿昔洛韦的衍生物，在 HSV-TK 的作用下转化为单磷酸 GCV ,继 而在哺乳类动物细胞激酶的共同催化作用下转化为细胞毒物质三磷 7 酸 GCV。它可与三磷酸核苷竞争 DNA 多聚酶的结合位点，阻止 单链 DNA 的延长，使细胞周期停滞在 S 期，抑制细胞分裂； （2）大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酶基因/5-氟胞嘧啶系统 胞嘧啶脱氨 基酶仅存在于细菌或真菌中，哺乳类动物细胞缺乏这种酶。该酶可 使 5-氟胞嘧啶转化为 5-氟尿嘧啶，继而形成单磷酸 5-氟脱氧尿苷。 它是一种不可逆的胸腺嘧啶核苷酸合成酶抑制剂，使脱氧核苷三磷 酸合成受阻从而抑制 DNA 的合成；（3）水痘-带状疱疹病毒胸苷 激酶(VZV-TK) 基因/5-(2-溴乙烯)-2-脱氧尿苷（BVDU)系统 实验 表明，VZV-TK 可作为一个自杀基因，但要以 BVDU 作为前药。 BVDU 三磷酸盐可结合到 DNA 链中，诱导单链断开。但 BVDU 活 化后的主要细胞毒性在于阻止细胞内胸核苷酸的合成，使脱氧尿苷 （dUMP）转化成脱氧胸苷（dTMP）；（4 ）suface-tethered bacterial CPG2stCPG2(Q)3基因/4-(2-chloroethyl)、 CMDA 系统 CPG2 能将 CMDA 水解产生苯甲酸苯酚和苯胺氮芥，或能过自溶反 应产生蒽环类抗肿瘤药，它的最大优点是产生的细胞毒物质为细胞 周期非特异性药物。免疫组化试验显示，即使在仅含有很小一部分 stCPG2(Q)3 表达的细胞中，在前药 CMDA 治疗下大部分细胞凋 亡，提示存在着巨大的旁观者效应。 五、多药耐药基因治疗 多药耐药(MDR)是指肿瘤细胞接触一种抗癌药物产生耐药同时 也对其他结构和作用机制不同的药物获得耐药。肿瘤细胞的多药耐 药性及大剂量化疗的严重骨髓抑制是现阶段临床上化疗失败的主要 原因。目前已分离了两种多药耐药基因: MDR1、MDR3, 其中 MDR1 与肿瘤细胞典型多药耐药有关。它仅有一个开放性阅读框架, 可编码 1280 个氨基酸的高度糖基化的跨膜蛋白P- 糖蛋白( P- gp) , 其中分子量为 170 103, 故又称为 p170。Taka- hashi 等在乳腺 癌的 MDR1 基因治疗临床研究中发现, 进展期乳腺癌和复发性乳腺 癌患者行大剂量化疗的同时, 移植已转入 MDR1 基因的自体同源外 周干细胞,而后再用多西他奇化疗, 能明显抑制肿瘤生长改善预后, 无其他明显的不良反应。 六、抗肿瘤血管形成基因治疗 肿瘤的生长和转移是一个依赖于血管生成的过程。血管形成是 包括内皮细胞的激活、增殖、迁移、血管基底膜的破坏、血管和血 管网的形成，以及先前存在的血管网的连接等复杂过程。肿瘤血管 生成是由肿瘤细胞和肿瘤浸润炎症细胞如巨噬细胞或肥大细胞产生 的促血管生长因子所介导的。促血管生长因子是肿瘤生长所必需的， 不少细胞因子与肿瘤血管形成密切相关，其中内皮抑素、血管抑素 和干扰素d 是目前研究的重点。人们利用各种基因治疗载体将抗 血管生成因子包括内皮抑素、反义血管内皮细胞生长因子(VEGF) 、血管抑素和干扰素一仅等运送到体内，以期望抑制肿瘤的生长。 Chen 等用编码内皮抑素和血管抑素的质粒在体内有效地抑制了血管 的生成，瘤内注射 PCIEndo 和 PCIAngio 能分别使肿瘤体积缩 小 36和 49。Gyorfy 等 分别使用鼠源性血管抑素和 IL 一 12 瘤 9 内注射(Ad Anglo 和 AdIL12)治疗乳腺癌动物模型，结果 AdAngio 显著抑制了肿瘤的生长，65 的肿瘤退化；Ad IL 一 12 引起 20 肿瘤退化，l3 肿瘤完全消失。二者联合注射使 96 的肿瘤退化，54 完全消失，并且提高了动物对再次接种的 肿瘤细胞的免疫力。目前所知作用最强的促血管生长因子是 VEGF，学者们正致力于研究开发 VEGFVEGFR 的抗血管生成潜 力。张淑华等 通过 RNAi 抑制 VEGF 表达的抗血管生成疗法，也发 现可以明显抑制乳腺癌细胞的增殖。 7 应用溶瘤病毒的治疗 溶瘤病毒不是靠携带外源基因转染肿瘤细胞杀伤肿瘤细胞，而 是通过直接感染肿瘤细胞后“溶解”肿瘤细胞。常见的溶瘤病毒包括 突变的腺病毒 ONYX-015(dl1520) 、HSV-1 突变体 G207、人类逆 转录病毒- 3、水泡性口炎病毒(VSV)和