分枝杆菌 微生物学检验

分枝杆菌 1. 分枝杆菌属 (Mycobacterium)： （1）一类细长、略带弯曲、呈分枝状生长细菌，革兰染色阳性，无芽胞、无荚膜； （2）抗酸染色阳性，故又称抗酸杆菌； （3）营养要求较高，常用罗琴培养基； （4）生长缓慢，28 周后方可见菌落； （5）G+C mol%为 62%70%； （6）由于结核分枝杆菌的耐药和 AIDS 发病率呈上升趋势，结核病成为危胁人类健康的一 个严重的全球性公共卫生问题。 2. 主要致病种类：人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌 3. 分枝杆菌属分类 （1）典型结核分枝杆菌：人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分 枝杆菌 （2）非典型分枝杆菌： （3）其他：副结核分枝杆菌、麻风杆菌、鼠麻风杆菌 4. 结核分枝杆菌 （1）临床意义 A. 本菌抵抗力强，可存活 68 月，随着漂浮于空气中的微滴核被吸入呼吸道，植入肺 泡发育繁殖导致结核发生； B. 引起结核病，随社区人群生活状况不同发病率有所差异，全球约有 1/3 人感染，有 人类死亡之首和白色瘟疫之称； C. 免疫性：有菌免疫或称传染性免疫，细胞免疫在抗感染免疫中起重要作用。 D. 细菌可经血、淋巴，在骨、关节、肾、脑膜等处引起相应的结核病 （2）致病物质荚膜：抗吞噬；细胞壁脂质；磷脂：刺激单核细胞增生、结核结节形成、干 酪样坏死；分枝菌酸：抗酸性；索状因子：破坏线粒体膜；蜡质 D：诱发 IV 型超敏反应； 硫酸脑苷脂：抑制吞噬细胞；蛋白质； 致病机制：胞内寄生，细胞免疫为主，在巨噬细胞中存活，引起 型超敏反应。 （3）结核结节的形成： A. 是单核细胞参与的炎性肉芽肿反应，是细胞免疫和 IV 型变态反应平衡的结果； B. 细菌的脂质抵抗吞噬，巨噬细胞被破坏，形成原发感染。36 周后，细胞变形，IV 型变态反应产生； C. 磷脂刺激巨噬细胞转化为上皮样细胞融合成多核巨细胞。抑制蛋白酶对组织溶解， 产生干酪样坏死； （4）Koch 现象（郭霍现象）和 IV 型变态反应： 有毒结核分枝杆菌被初次接种豚鼠 1014 天，局部产生小节，形成肿块坏死溃疡侵 入附近淋巴结淋巴血流全身播散，经久不愈动物死亡。说明初次感染，机体无免疫力 和超敏反应。 在 812 周之前先动物接种减毒小量结核分枝杆菌，再次接种结核分枝杆菌后局部反应 提早出现，23 天内红肿硬结溃疡痊愈。说明再次感染，机体有免疫力和超敏反应。 （5）微生物学检验 标本采集: 根据病变部位不同而定 (晨痰、支气管洗液、清晨的中后段尿) 运送: 消毒容器 直接检查: 萋-尼抗酸染色(热 )、Kinyoum 染色( 冷)，金-胺 O 染色 消化: 4%NaOH 37 1530 分钟；胰酶 -新洁尔灭法；4%硫酸法（尿标本） 培养分离：罗琴培养基 鉴定: 烟酸、硝酸盐还原、触酶 药物敏感试验 （6）直接涂片染色镜检：痰厚涂片，齐-尼抗酸染色后，至少观察 100 个视野。结核分枝 杆菌抗酸染色后呈红色，其他细菌和细胞为蓝色。结果应报告“找到或未找到抗酸性杆菌” ， 而不能报告“找到结核分枝杆菌” 。可用计数法排除其他分支杆菌。 （7）结核分枝杆菌形态特征： 细长、略弯曲杆菌，牛型结核分枝杆菌稍短； 排列成 团、成堆； 抗酸染色阳性，治疗后菌体呈非抗酸性 G+颗粒，称 much 颗粒（L 型变 异） ； 金胺“O”染色菌体 呈黄色荧光； （8）分离培养： 标本接种于选择性固体培养基中，常用罗琴培养基，所含的孔雀绿或青霉素可抑制杂 菌生长 37，510CO2 培养 8 周，如果出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落，涂片染色为 抗酸阳性，多数是结核杆菌。 鉴定：(1)PCR 反向膜探针杂交 EHSA 法(PCR 杂交梳)； (2)DNA 探针； (3)16s rRNA 基因序列测定； (4)高效液相色谱(HPLC) 检测 ； （9）培养特性： A. 最适温度 3537，最适 pH6.46.8； B. 专性需氧，在液体培养基上形成菌膜，有毒株呈索状生长； C. 营养要求高，专嗜甘油为碳源，常用罗琴培养基( 鸡蛋、甘油、枸橼酸钠、天门冬酸、 马铃薯粉、孔雀绿、钾镁离子)； D. 繁殖慢，一代需要 18 小时； E. 菜花样菌落，不规则凸起、不透明、粗糙，牛型结核分枝杆菌为光滑型； （10）生化反应：糖类发酵(-) 热触酶(-) Tween 水解(-) 热触酶(-) 热磷酸酶(-)，为结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌鉴定试验 ，后者阳性 烟酸试验(+) 硝酸盐还原 (+) 中性红(+) 烟酰胺酶试验(+) 脲酶试验 (+) 牛型分枝杆菌均为阴性 （11） 结核分枝杆菌鉴别试验 （12）结核分枝杆菌抵抗力： 温度：菌悬液 805min、痰标本煮沸 5min 完全杀死细菌 光线：对紫外线敏感 3 干燥：对干燥或干热抵抗力强，干燥痰中可存活数周 化学因素：75%乙醇 5min，石炭酸、来苏儿、甲醛敏感 （13）分枝杆菌属快速鉴定程序： （14）结核分枝杆菌快速鉴定技术 A. 快速分离鉴定：采用放射性 C14 棕榈酸的 7H12 培养液，细菌生长后生成 C14O2，能自 动显示测定结果，有 Bactec 460 系统、BacT/Alert 等 B. 基因检测 C. 核酸探针 D. PCR：注意假阳性的存在 E. 核酸指印技术 （15）结核菌素试验和卡介苗： 结核病是病原体和宿主相互作用，由细胞免疫介导的免疫病理反应和组织损伤的结果。 流行病学调查使用 5U 的 OT 和 PPD，若 1TU 呈强阳性，提示有活动性的结核。 5. 麻风分枝杆菌(M.leprae) （1）抗酸染色阳性, 短而粗, 呈束状或团状排列, 胞内寄生,胞质呈泡沫状称麻风细胞