含rgd序列环肽的设计与合成方法研究

含 RGD 序列环肽的设计与合成方法研究 初虹，陆冬冬（苏州中科天马肽工程中心有限公司，苏州 215101） 摘 要 ：目的 介绍含 RGD 序列的环肽的设计与合成方法。 方法 二硫键成环、酰氨键成 环和 click 反应成环是含 RGD 序列环肽的主要成环方式。结果 三种方法应用越来越多， 易于得到低消旋，高产率的产物。 结论 设计与合成有高稳定性和高生物活性的含 RGD 序列的环肽是含 RGD 类多肽研究的主要方向。 关键词：RGD 序列;环肽;合成 ;Click 化学反应 近些年，人们对含RGD序列的环肽及其类似物的研究越来越热。RGD序列即含有精氨 酰-甘氨酰天冬氨酸（Arg-Gly-Asp)的三肽序列，该三肽序列是细胞中粘附蛋白的功能序 列，最初是在细胞外基质（简称ECM）中获得的。在细胞生长过程中正常细胞只有粘附于 一定的基质才能生长，脱离了基质细胞生长就会很快停止于Gl期或 G0期。整合素 (Integrin)即RGD受体的统称 1，整合素介导着许多种类的细。细胞及细胞底物间的相互 作用，参与许多生物学过程。如体内平衡调节，细胞粘附，细胞迁移，细胞内信号传递过 程，淋巴细胞识别，血小板的凝聚等。含RGD序列的粘附蛋白在细胞粘附中起重要作用 2。 药理学实验表明，许多含RGD序列的小分子片段可抑制细胞的粘附。许多病理学过程如血 栓形成，肿瘤组织的转移等都与细胞粘附作用有关。因此RGD类多肽的粘附性成为药物设 计的新靶点，含RGD序列的多肽或化合物有望治疗一些与细胞粘附作用相关的疾病。 很多线性肽在体外具有较好的生物活性和稳定性，但由于体内存在各种各样的酶，这些 酶的存在会破坏活性肽的结构，从而导致其在体内半衰期短，生物利用度低。对于需要大 量用药的治疗方案来说，无疑会大大增加医疗费用，并可能导致意想不到的治疗风险。因 此，增加肽类化合物的稳定性，提高肽的生物活性和生物利用度是很多药学工作者所努力 的方向。除了改变多肽类药物的剂型，从而延长其半衰期，增强其抗酶解能力外，将肽链 的主体或部分设计为环形结构，也是增加多肽生物稳定性的有效方法之一，并且有大量的 科学实验已证明了这一点。笔者在平时的工作中也遇到过很多含RGD序列的环肽，现对含 RGD序列的不同环肽的合成方法在这作一概述。 1 通过二硫键成环的含 RGD 序列的环肽 由于 Cys 的侧链-SH 易于氧化成 S-S 键，因此可采用此特性将线性肽氧化成环肽。笔 者在平时的实验中也遇到很多通过二硫键成环的含 RGD 序列的环肽，其通式为-X 1c(CRGDC) X2-。合成的思路一般是先用固相法合成线性肽树脂，采用缩合剂 DIC/HOBt,HBTU/HOBt/NMMM 或 PyBOp/HOBt/NMM 等，然后采用液相氧化。二硫键的形成也可 以通过固相氧化如 I2,K3Fe(CN)6，空气，Tl(tfa) 3等，但固相法氧化中间过程不容易控制， 氧化条件难以掌握，所以一般采用液相氧化，可以通过 HPLC 随时跟踪检测。液相氧化时多 肽浓度一般在 0.10.5mg/ml,可通过空气氧化 4，将脱保护游离出半胱氨酸-SH 的多肽溶 于水中，在近中性或弱碱性(PH6.510)，在空气中搅拌自然氧化，时间一般需要 24h 以上。 此法的有点是：副产物为水，纯化方便。缺点是氧化时间长且很难氧化彻底。H 2O2氧化因 具有副产物为水，氧化迅速，纯化方便等优点，因此是我们用的最多的一种氧化方法。氧 化前将粗肽用水溶解完全，可加适量 DMSO,醋酸等助溶。用氨水或 NaHCO3调 pH 到 7.27.4 之间，加 1020 倍量左右的 10H 2O2，反应一般在 30min2h,用 HPLC 跟踪检测 氧化是否完全。氧化完全后用醋酸调 PH 值到 45 左右，加少量 Vc 防止过氧化。文献中报 道液相中氧化二硫键还可以用 20%DMSO 水溶液氧化，反应 14h,可在 PH38 范围内适用， 对碱性或疏水性的肽尤其适用。除此之外，还可用 I2,K3Fe(CN)6，N-碘代琥珀酰亚胺（NIS)氧 化，氰化碘（ICN）,锍盐氧化，Npys 氧化法，都有相应的环化实例。 2 通过酰胺键成环的含RGD序列的环肽 关于环肽的合成有很多的文献报道，从成环方式上可分为三种方式 5：（1）头尾成环 脱去 N 端保护, 游离的氨基进攻肽链的 C 末端。 （2）侧链-侧链成环, 即侧链的氨基( 如 Lys , Orn) 与侧链的羧基 (如 Asp , Glu) 成环。(3) 侧链有羧基的氨基酸与 N 端成环。从合 成方法上又可分为溶液合成法和固相合成法两种 6，溶液合成法是在高度稀释的溶液中进 行的（一般为 10-310 -4mol/L）,将裂解下来的线性肽在缩合剂的加入下成环，也可先将 C 端活化再成环。C 末端活化的方法有活泼酯法，叠氮法，硫酯法或加入辅助试剂成环。固 相法成环是在树脂上成环，然后脱落下来，避免了分子间的聚合。据文献报道常用的树脂 有 MBHA,OXime,PAM 等树脂。 笔者合成过的含 RGD 序列的环肽有X 1RGDX2-或-RGDX 1X2-等形式。如笔者曾经合成过 RGDFK 序列的环肽,在 G 和 D 之间通过酰胺键成环。线性肽用固相合成法合成，环化用溶液 法环化。具体步骤：先用固相法制备 DKFRG-CTC Resin,再加入 TFE:DCM=2:8 裂全保护肽， 得到 NH2-D(OtBu)-K(Boc)-F-R(pbf)-G-OH。此环化所用的缩合剂为 PyBOP:HOBt:NMM:全保 护肽3:3:6:1(为 mol 比)，称好 PyBOP/HOBt 溶于 DCM 中，再将全保护肽溶于 DCM 中，通 过恒压滴液漏斗缓缓滴入缩合试剂中，控制环化时肽浓度在 0.5mg/ml 左右。环化时间 24h,中 间可以通过 HPLC 监测主峰保留时间变化，以此初步判断环化是否完全。此实验中在环化接 近 24 h 时，HPLC 检测已环化上 95，将 DCM 旋去，加裂解试剂裂解得到环化后的粗肽， 最后分析制备，最终计算环化收率在 30左右。 除了上述含 RGD 类型的环肽外，还有些带侧链修饰的 RGD 序列。如 cyclo(DYKRG),因 K 侧链含有-NH 2,可在其上接各种修饰基团，如 FITC,DOTA 等。本实验室常采用的通用合成路 线是首先用 2CTC Resin 作为载体，用 Fmoc 固相合成法合成线性肽树脂，再裂解全保护 肽，使用 PyBOP/HOBt/NMM 或 PyAOP/HOBt/NMM，或 HATU/HOBt/NMM 作为缩合剂进行液相环 化，理论上后两种缩合剂活性更高，但价格昂贵，大量合成时不利于降低成本。通过 HPLC 检测环化过程，最后再旋去 DCM，加裂解试剂裂解得到环化初肽，最后通过反相 HPLC 分析 纯化。虽然进行液相环化容易产生二聚物或多聚物，但液相环化是经典的合成方法，此合 成路线简单易掌握，有实验证明特别适合环八肽的合成 7。 3 通过此 click 化学反应（叠氮与炔成环）的含 RGD 序列的环肽 一般情况下，短肽（如四肽）的首尾环化很困难。一方面由于分子间容易聚合产生聚 合物，另一方面由于处于环化过渡肽的四肽分子环张力很大导致环化失败。有文献报道 8, 通过使用 1,4二取代 1,2,3-三唑作为环化的桥梁，这些三唑化合物具有类似于肽键的原 子取代和电子效应，可以通过 Cu+催化使叠氮和炔一步成环。如有人使用这一 click 化学 反应类型成功合成了 cyclo-(L)-Pro-(L)Val-(trizaole)-(L)Pro-(L)Tyr，收虑达到 了 70。在合成过程中对环化条件进行了一系列的摸索，确定此反应的最佳反应条件是： CuBr(0.2eq),DBU(3eq),用甲苯做溶剂，在 110下加热回流 16h。 笔者合成过类似的环肽，其肽序为 cyclo(2-Propynylamine)-D-G-R-E-G-N3),通过 click 化学反应成环，合成的思路如下：先用 2CTC Resin 作为载体，用 Fmoc 固相合成 法合成线性肽 2-Propynylamine-D-G-R-E-G-N3，在固相上再使叠氮甘氨酸与炔通过 click 反应成环。环化反应如下图所示： 、 N3-GE-RG-DNH-CCH NGECyclization NHD RGRESIN RESIN 笔者对成环的条件我们进行了摸索，条件一：CuBr(0.2eq),DBU（3eq） ，在 110下 将肽树脂用甲苯加热回流 16h。条件二：CuBr(0.2eq),DBU（3eq） ，用甲苯做溶剂，在 50 下将肽树脂油浴加热反应 12h。条件三：CuBr(0.2eq),DBU（3eq） ，Vc-Na(3eq),用 DMF 做 溶剂，使用肽树脂固相环化 12h。条件四：CuBr(1eq),DBU（3eq）,用 DCM 做溶剂，裂解全 保护肽后在 DCM 中环化 3h。经过多次反复实验比较，此含 RGD 序列的环肽成环最佳反应条 件应采用条件四，总收率可达到 40%。 含 RGD 序列的环肽及其类似物的环化也可以在溶液中进行。一般方法是先使用 2chlorotrityl chloride Resin 在为载体，采用 Fmoc 固相合成法合成线性肽树脂，再 裂解得到全保护肽，然后在溶液中环化，使用 HPLC 跟踪反应进程。 随着 RGD 序列环肽的研究和应用越来越广泛和深入，如何简化工艺路线，得到低消旋， 高收率，高生物活性和高稳定性的 RGD 环肽及其类似物是今后合成研究努力的方向。 REFERENCES 1 RUO Z G, QIU C L, XIE P. 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