干细胞分选技术

干细胞分选技术 干细胞是一类具有自我复制和分化潜能的细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞 。新近研究表明干细胞可以为临床细胞替代治疗和移植治疗提供新的细胞来源 ，有广阔应用前景。 干细胞的分类 根据干细胞的来源、发育阶段、分化趋势将它们分为两大类：ES 细胞和成体干 细胞（或称之为特定组织干细胞，如造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干 细胞等）。 ES 细胞：ES 细胞是从附置前早期胚胎内细胞团或附置后胚胎原始生殖细胞分 离克隆的一类具有自我更新能力和发育全能性的，并能产生分化后代能力的早 期胚胎细胞，包括畸胎瘤干细胞(EC 细胞)，ES 细胞 ,胚胎生殖细胞(EG 细胞) 。它们的基本特性是具有发育的全能性，能分化为属于外胚层、中胚层和内胚 层的各种分化细胞，即具有分化成为机体内任何一部分组织和器官的能力，因 而有人称之为“万能” 细胞。 成体干细胞：成体干细胞也称为特定组织干细胞，是指成体组织中所存在的具 有自我更新与产生本系统后继续分化能力的那类细胞，它们在特定的条件下， 可以对称地分裂为 2 个新的子代干细胞或 2 个功能细胞，也可以不对称地分裂 成 1 个子代干细胞和 1 个功能干细胞，从而使组织分化成与器官保持生长和衰 退的动态平衡。 干细胞的应用 随着细胞替代治疗的发展，干细胞 移植治疗已成为临床上治疗某些疾病的重要 手段，利用干细胞在体外扩增培养并诱导成所需要的细胞后移植入患者体内， 用于组织损伤的修复、退行性器官的替代及改善遗传性缺陷组织器官的功能。 而成体干细胞可塑性分化的发现，为细胞替代治疗提供了新的种子细胞。 干细胞的分离纯化 所谓细胞分离（cell isolation）,指的是将组织分散制成细胞悬液后从中获取目 的细胞的过程。而所谓细胞纯化更进一步强调从原代培养前成分混杂的异质性 细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。通过细胞的分离和纯化 过程，使培养物成为单一类型培养物，甚至是遗传特性完全一致的培养物，后 者即细胞系。分离和纯化两个概念之间没有截然的界限，许多情况下，细胞分 离和纯化并不是完全彻底的，培养物中只能达到以某种细胞为主的程度，所以 也成称为富集(enrichment)。 分离和纯化细胞的过程不仅仅在原代培养之前进 行的，有时分离和纯化细胞的过程还贯穿于原代培养和继代培养的过程中，甚 至是主要依赖培养过程实现分离和纯化细胞的目的。培养物中细胞成分是否单 一或者目的细胞在培养物中的比例如何，常是衡量某一培养工作是否成功的重 要指标。 干细胞的分离纯化、密度梯度离心技术、逆流淘析分离技术、利用细胞表面标 志分离纯化细胞的方法等。 密度梯度离心技术 利用细胞体积和密度进行分离纯化的技术均基于沉降作用。其基本原理是，在 离心力的作用下，细胞在一定介质中的的沉降速率与细胞的体积及细胞密度和 其周围介质的密度之差成正比。细胞的体积越大，其余分离介质的密度差越大 ，则细胞的沉降速率越快。对于特定的待分离细胞来说，其体积和密度是恒定 的，可供选择的只是具有一定密度与黏度的分离介质。使之沉降的细胞密度应 该比介质大，而使之漂浮的细胞密度应该比介质小。因此实施沉降技术分离细 胞的关键在于选择密度梯度形成介质，故称将技术也称为密度梯度离心技术。 逆流淘析分离技术是通过含细胞介质溶液的流力和福利与细胞所受离心力之间 相互作用而分离细胞的一种技术。细胞置于一特殊的离心室中，离心室成锥形 状，其定点指向沉降方向，细胞悬浮于以向心方向连续流动的介质溶液中，同 时受到离心力的作用。当向外的离心力于内向的流立即浮力达到平衡时，每个 细胞将按照它的的沉降速率达到其平衡位置。通过这一技术可进一步分离淋巴 细胞和单核细胞。 选择性细胞凝集 羟乙基淀粉和甲级纤维素可以使红细胞形成大的“钱串”，加速其沉降，从而比 其他细胞更快地从造血细胞悬液中沉降出去。这一方法通常用于快速去除大量 成熟红细胞，而不会对有核细胞群造成太大的损失。但是，与上面提到的密度 梯度离心和逆流淘析步骤一样，这一方法并没有使干细胞群相对于有核细胞发 生太多的富集。 基于不同粘附特性的细胞分离方法 粘附于某些固相物质如玻璃或塑料的表面，使某些类型细胞的基本生物学特性 之一，但另一些细胞却缺乏这种能力；或某些细胞的粘附能力强，粘附作用快 ，而某些细胞的粘附能力弱或粘附作用慢。根据这些差异，可以分离或消除某 些类型的细胞。这种将粘附较快的细胞与粘附较慢的细胞（货物粘附能力）的 细胞分离开来并分别收集的处理过程就称为差粘附处理。差速粘附处理常用于 分离细胞悬液中的成纤维细胞与其它组织细胞。 利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法 单克隆抗体的特异性和多样性是利用不同抗体的合理组合分离不同类型的细胞 成为可能。目前抗体介导的细胞分离技术主要有：抗体/补体介导细胞溶解法， 流式细胞仪分选法，平面粘附分离法，免疫磁珠分离法等。从抗体介导技术获 得细胞的家渡看，又可分为阳性细胞分选法和阴性细胞分选法。拟从混杂细胞 群体中获得表达与抗体相应膜抗原的细胞群，称为阳性细胞分选法；反之，拟 除去表达与抗体相应膜抗原的细胞，而收集其余的细胞群体，称为阴性细胞分 选法。其中上述抗体/补体介导细胞溶解法为阴性细胞分选法，其余 3 种方法既 可以作为阳性细胞分选技术，也可以作为阴性细胞分选技术。 免疫溶解法 当补体存在时，用抗细胞某一表面标志的特异性抗体与异质性细胞一起孵育， 可以是具有该特异性表面标志的细胞溶解。利用这一原理，将消除细胞的特异 性表面标志的抗体和补体加入细胞须阿毕业或细胞培养物中，使抗体及补体作 用于具有相应抗原的细胞并溶解之，而对该抗原阴性的细胞进行富集。细胞溶 解法适用于细胞悬液或细胞培养物中待消除细胞数量不是很大的情况。 流式细胞分选术 流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是 70 年代初发展起来的一项高新技术 ，综合应用光学、机械学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、分子免疫学 等学科技术，对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定和分析的方法。80 年代开始从基础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测。 流式细胞术是对单个微粒（如细胞、微生物和人工合成微球等）进行快速定量 分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振 荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出 散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号（分别代表荧光、散射光、光吸 收或细胞光阻抗），送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选 出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达 99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪 器称为流式细胞计（flow cytometer）。 免疫磁珠分选技术 用免疫磁珠做细胞分选(MACS)是高效简捷的免疫细胞及其它细胞的分离纯化方 法。 原理是已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合，或者已包被二 抗的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。磁珠携带与之结合的 细胞吸附于分离柱/试管上，实现阳性细胞分离或